作者：陈秋燕 卢奕 张健 郭翔 麦海强 洪明晃
【摘要】 【目的】 探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-6(igfbp-6)在鼻咽癌患者病理组织中的表达与鼻咽癌患者临床特征与预后关系及其对鼻咽癌细胞株增殖的影响。【方法】 采用免疫组化方法检测76例晚期鼻咽癌患者病理组织中igfbp-6的表达，并对igfbp-6的表达与鼻咽癌患者临床特征与预后关系进行探讨;用mts方法检测igfbp-6对鼻咽癌细胞株cne2增殖的影响。【结果】 鼻咽癌igfbp-6的表达阴性组和阳性组患者的5年总生存率分别为27%和73%(生存分析p = 0.007)，5年无局部区域复发生存率分别为38%和75%(p = 0.001)，5年无远处转移生存率分别为53%和89%(p = 0.002)。cox模型多因素分析显示igfbp-6的表达是76例鼻咽癌患者独立的预后影响因素(p = 0.002)，igfbp-6阳性表达患者局部区域复发及远处转移风险降低。mts检测结果显示igfbp-6能够抑制人低分化鼻咽癌细胞株cne2的生长增殖(p < 0.05)，并且这种作用呈剂量依赖性。【结论】 鼻咽癌组织中igfbp-6的表达是晚期鼻咽癌患者的局部区域复发及远处转移风险有关的因素，其阳性表达提示患者局部区域复发及远处转移风险降低。Www.11665.CoM体外mts实验证明igfbp-6能够抑制cne2增殖。
【关键词】 鼻咽癌; igfbp-6; 预后; 增殖
abstract： 【objective】 to evaluate the expression of insulin-like growth factor binding protein-6 (igfbp-6) in nasopharyngeal carcinoma (npc) patients and determine its clinical and prognostic significance. to study the effect of igfbp-6 to npc cell in the proliferation. 【methods】 in this study， we evaluated immunohistochemical expression of igfbp-6 in npc tissue and determined its clinical and prognostic significance. the effect of igfbp-6 to npc cell line cne2 in proliferation were detected by mts. 【results】the 5-year overall survival (os) rates of igfbp-6 of negative group and positive group were 27% and 73% (survival analyses p = 0.007). the 5-year loco regional relapse-free survival (lrfs) rates were 38% and 75% (p = 0.001). the 5-year distant metastasis-free survival (dmfs) rates were 53% and 89% (p = 0.002). multivariate analysis in cox model showed that igfbp-6 were independent significant prognostic factor for 76 npc patients. the positive expression of igfbp-6 indicates a lower risk of developing loco regional relapse and distant metastasis. mts showed that igfbp-6 could decrease proliferation of cne2 (p < 0.05) and this function was dose-dependent. 【conclusion】 igfbp-6 is an independent significant prognostic factor for loco regional 胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor， igf)，是属于小分子多肽类生长因子，其氨基酸序列和胰岛素近似而得名。igf的主要作用是调节碳水化合物、蛋白质和脂类的代谢，在肿瘤领域中，igf与细胞增殖、分化和凋亡的关系日益受到关注。igf系统由igf-i和igf-ii及其受体和包括igfbp-1 ～ igfbp-6的6类结合蛋白等共同组成。igfbp-6(insulin-like growth factor binding protein， igfbp-6)是igf系统里结合蛋白的一类，能够通过与igf-ii特异性结合起到抑制细胞增殖的作用[1-2]。现有的研究试验证据表明igfbp-6是潜在的抗癌新靶点，研究显示igfbp-6的正向调节与抗增殖效应是一致的。igfbp-6作为igf-ii的抑制因子，在一些肿瘤细胞中的表达随细胞恶性程度的增高而降低。体内外实验表明igfbp-6能够抑制某些肿瘤细胞生长，包括结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、横纹肌肉瘤等[2-5]。鼻咽癌俗称“广东瘤”，其发病具有明显的地区差异性。鼻咽癌在东南亚地区及中国华南地区常见，而欧美国家发病率较低。鼻咽癌治疗失败的最主要原因是远处转移，目前鼻咽癌远处转移的机制尚不明确，国内尚没有可靠的生物学指标预测转移。国内外尚未有关于igfbp-6与鼻咽癌相关研究的报道，本研究的目的是检测晚期鼻咽癌患者病理组织中igfbp-6的表达，并探讨igfbp-6的表达与鼻咽癌临床特征与预后的关系，体外用mts方法检测igfbp-6对鼻咽癌细胞增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 临床资料
选取1998年9月至2002年12月在中山大学肿瘤防治中心行鼻咽活检的鼻咽癌病人石蜡包埋组织76例。全组病例均经病理确诊，76例病人病理类型均为鼻咽低分化鳞癌。其中男性58例，占76.3%，女性18例，占23.7%。年龄23 ～ 64岁，中位年龄47岁。根据中国鼻咽癌92福州分期标准，初诊时t1期4例，t2期12例，t3期24例，t4期36例;n0期10例，n1期16例，n2期30例，n3期20例;临床总分期：iii期24例，iv期52例。所有患者均在中山大学肿瘤防治中心接受根治性放疗。所有病人具有完整的存档病历及随访资料。随访时间截止到2009年3月，76例病人的中位随访时间为86.5个月(14 ～ 124个月)。随访期内局部区域(包括鼻咽及颈部淋巴结)复发28例，复发率为36.8%(28/76)，远处转移(包括骨、肺、肝)18例，转移率为23.7%(18/76)，5年总生存率为60%(46/76)。
1.2 实验方法
1.2.1 免疫组织化学检测
实验主要试剂鼠抗人igfbp-6单克隆抗体购自美国r&d公司。采用免疫组化sabc法常规操作技术，具体如下：①组织蜡块病理切片，每张切片厚4 ?滋m，放置55 ～ 58 ℃烤箱烤片30 ～ 45 min。②石蜡切片常规二甲苯溶液脱蜡，梯度酒精逐级水化，去离子水漂洗。③玻片浸泡在5 ml 300 ml/l过氧化氢 + 22.5 ml甲醇 + 22.5 ml去离子水中10 min。消除组织内源性过氧化物酶的影响。去离子水及pbs缓冲液漂洗。④将玻片抹干，画圈。⑤滴加含100 ml/l正常山羊血清的用1%bsa稀释pbs的封闭抗原，湿盒内室温下放置60 min。⑥滴加鼠抗人igfbp-6单克隆抗体(浓度1：30)，4 ℃冰箱湿盒过夜。⑦滴加生物素标记的第二抗体(浓度1：200)，湿盒内室温下放置30 min。⑧滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，湿盒内室温下放置30 min。⑨dab显色约5 min，显微镜下显示最适合阳性结果时，去离子水终止显色。⑩苏木素复染10 s。?輥?輯?訛玻片脱水。?輥?輰?訛中性树胶封片。显微镜下观察。
1.2.2 mts检测细胞增殖能力
cne2是鼻咽癌低分化鳞癌细胞株，由中山大学肿瘤防治中心钱朝南教授馈赠。在含有100 ml/l小牛血清、100 u/ml青霉素和100 mg/l链霉素的dmem培养液，及在37 ℃、体积分数5%co2条件下培养。重组人igfbp-6购自r&d公司。采用mts检测细胞增殖能力，具体如下：①准备3块96孔板，每孔3 000个cne2细胞铺板，每孔接种200 ?滋l，每组4 孔，置co2培养箱中孵育。②第2天将dmem培养液100 ml/l fbs调整为10 ml/l fbs培养，并加入不同浓度重组人igfbp-6各为4 ?滋l，使igfbp-6的终浓度分别为0、0.01 ng/?滋l、0.1 ng/?滋l、1 ng/?滋l。③加处理条件后24，48，72 h，加入mts 20 ?滋l每孔，继续co2培养箱中孵育。④加入mts 2 h后终止培养，用酶联分光光度计测量490 nm处的od值，以相应od值表示细胞增殖能力的大小。⑤实验重复3次，取3次实验结果的平均值作为最终的实验结果。
1.3 免疫组化结果判定
细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达。每张切片在200倍普通光镜下随机计数10个视野，计算肿瘤组织中染色阳性细胞的比例，多于50%的肿瘤细胞为阳性表达被认为igfbp-6表达阳性。
1.4 统计学处理
采用spss 13.0统计软件进行统计处理。数据以均数 ± 标准差表示，显著性检验采用方差分析。两因素间差异的比较采用?字2检验。采用kaplan-meier法计算生存率，两因素间生存差异检验采用log-rank检验。采用cox比例风险模型进行预后的多因素分析。p < 0.05时差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 igfbp-6在鼻咽癌组织中的表达与临床特征的关系
igfbp-6的阳性表达显示棕黄色染色主要位于肿瘤细胞的胞浆内(图1b)，而igfbp-6的阴性表达没有明显棕黄色染色(图1a)。76例鼻咽癌组织54例表达阳性，阳性率为71.4%。对76例鼻咽癌病人各项临床特征与igfbp-6的表达进行单因素分析，结果显示igfbp-6的表达与性别、年龄、t分期、n分期、临床总分期无明显相关性(p > 0.05，表1)。
2.2 igfbp-6表达与预后的关系
kaplan-meier分析结果显示igfbp-6阴性组和阳性组的5年总生存率分别为27%和73% (p = 0.007，图2)，igfbp-6阴性组和阳性组的5年无局部区域复发生存率分别为38%和75% (p = 0.001，图3)，igfbp-6阴性组和阳性组的5年无远处转移生存率分别为53%和89% (p = 0.002，图4)。结果表明igfbp-6阳性组较阴性组病人生存时间较长，局部区域复发及转移率较低。采用cox比例风险模型分析年龄、性别、t分期、n分期、临床总分期及igfbp-6表达等多种因素与预后的关系。多因素分析结果显示igfbp-6表达是76例鼻咽癌患者独立的预后影响因素(p = 0.002，表2)。影响预后的独立因素还包括临床总分期。
2.3 mts检测igfbp-6对鼻咽癌细胞珠的生长增殖的影响
用mts法测定不同浓度重组人igfbp-6对鼻咽癌低分化细胞株cne2的生长增殖的影响。共测定72 h，得到的od值计算平均数，绘制生长曲线如图5。结果显示igfbp-6能够抑制人低分化鼻咽癌细胞株cne2的生长增殖(p < 0.05)，高浓度的重组人igfbp-6(1 ng/?滋l)较低浓度的作用明显，即抑制作用呈剂量依赖性。
3 讨 论
鼻咽癌发病的最大特点是分布具有地区差异性，是中国南方地区常见的恶性肿瘤，放射治疗是鼻咽癌的首选治疗。随着放疗imrt技术应用的推广，鼻咽癌的局部复发率不断下降，生存率得到不断的提高。但是，晚期鼻咽癌的远处转移率仍然较高。有报道显示，放疗结合化疗可以在一定程度上降低鼻咽癌的局部复发和远处转移率[6]。因此，预测鼻咽癌病人远处转移的风险对于判断预后及指导综合治疗具有重要意义。本研究的目的是希望寻找可靠的生物学指标来帮助预测预后及指导治疗。
作为生长因子的一种，igf在肿瘤研究中的作用越来越受到重视。越来越多流行病学研究提示血清igfs水平增高和/或结合蛋白水平的改变与一些恶性肿瘤发生风险增加相关[7]。furstenberger等[8]的文章指出，igf-i对细胞增殖分化起着重要的作用，并能够抑制细胞的调亡;许多前瞻性研究提示：igf-i水平升高，人群中发生前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤的风险增加。lloret等[9]随访56例宫颈癌患者，发现igf-ir高表达患者预示着预后不良。liao等[10]的研究显示，前列腺癌患者igf-i和igf-ii的表达与临床分期密切相关，其表达水平的升高预示着预后不良。haydon 等[11]检测了526例结直肠癌患者血清igfbp-3的表达，发现其表达水平的增高预示着较好的预后。有研究发现，在乳腺癌患者血清igfbp-6的表达明显低于乳腺良性增生的患者，并且igfbp-6的表达与psa的表达呈负相关[12]。cacalano等[13]报道在口腔肿瘤中，igfbp-6因子能够促进肿瘤细胞的调亡，igfbp-6基因或者是蛋白表达增高的口腔肿瘤患者，预示着有较好的预后，igfbp-6能够作为口腔肿瘤患者的预后指标。在鼻咽癌中关于igfs的研究很少，iwakiri等[14]的研究显示，ebv感染能够诱导鼻咽癌细胞株c666-1的igf-i的表达。zhang等[15]用免疫组化检测良性病变鼻咽血管纤维瘤或鼻息肉患者的病理组织标本，结果显示igf-ir表达为阴性。
本研究中，cox模型分析显示igfbp-6表达是76例晚期鼻咽癌患者独立的预后影响因素，igfbp-6阳性表达提示患者局部区域复发及远处转移风险率降低。本研究结果提示，igfbp-6可以考虑作为鼻咽癌的一个预后指标，本研究结果与前述igfbp-6在乳腺肿瘤、口腔肿瘤等患者表达情况及预后关系基本一致。我们可以考虑将igfbp-6纳入鼻咽癌患者治疗前检查的参考指标，对于表达阴性的患者，因为有可能有较高的局部复发率及远处转移率，治疗方案考虑予以放化疗等综合治疗手段，并密切随访，及早治疗可能出现的远处转移。
目前体内外实验证实igfbp-6对不同肿瘤细胞生长具有抑制作用。oh等[2]对大肠癌细胞株ht-29的研究表明，igfbp-6表达增高能够加强与igf-ii的紧密结合，抑制肿瘤细胞的增殖。有报道在横纹肌肉瘤细胞中，体外实验证明igfbp-6能够抑制肿瘤细胞的增殖，促进细胞的调亡;将igfbp-6表达沉默的肿瘤细胞进行小鼠体内皮下注射，肿瘤细胞的生长增殖及转移能力明显增强[5]。koike等[3]的研究表明，在前列腺癌的治疗中，已烯雌酚通过诱导igfbp-6的表达来抑制前列腺癌雄激素非依赖性细胞的增殖。sueoka等[4]报道在非小细胞癌的研究中，igfbp-6能够诱导肿瘤细胞的程序性死亡，提示igfbp-6是肿瘤治疗的潜在靶向药物。
本研究中，鼻咽癌组织中igfbp-6的阳性表达对预后的影响，即有可能降低鼻咽癌病人局部区域复发及远处转移风险，提示其有可能在一定程度上抑制鼻咽癌的生长增殖及转移，可能是鼻咽癌治疗的新靶点。并且mts检测结果显示igfbp-6能够呈剂量依赖性抑制人低分化鼻咽癌细胞株cne2的生长增殖。综上所述，igfbp-6是值得进一步深入研究的生物学指标。可以考虑增加病例数，扩大样本量，行相关的动物实验研究，为进一步临床生物学研究打下基础。
【参考文献】
frasca f， pandini g， sciacca l， et al. the role of insulin receptors and igf-i receptors in cancer and other diseases [j]. arch physiol biochem， 2008， 114(1)： 23-37.
oh ys， kim ej， schaffer bs， et al. synthetic low-calcaemic vitamin d(3) analogues inhibit secretion of insulin-like growth factor ii and stimulate production of insulin-like growth factor-binding protein-6 in conjunction with growth suppression of ht-29 colon cancer cells [j]. molecular and cellular endocrinology. 2001， 183(1-2)： 141-149.
koike h， ito k， takezawa y， et al. insulin-like growth factor binding protein-6 inhibits prostate cancer cell proliferation： implication for anticancer effect of diethylstilbestrol in hormone refractory prostate cancer[j]. br j cancer， 2005， 92(8)： 1538-1544.
sueoka n， lee hy， wiehle s， et al. insulin-like growth factor binding protein-6 activates programmed cell death in non-small cell lung cancer cells[j]. oncogene， 2000， 19(38)： 4432-4436.
gallicchio ma， kneen m， hall c， et al. overexpression of insulin-like growth factor binding protein-6 inhibits rhabdomyosarcoma growth in vivo [j]. int j cancer， 2001， 94(5)： 645-651.
langendijk ja， leemans cr， buter j， et al. the additional value of chemotherapy to radiotherapy in locally advanced nasopharyngeal carcinoma： a meta-analysis of the published literature[j]. j clin oncol， 2004， 22(22)： 4604-4612.
jerome l， shiry l， leyland-jones b. deregulation of the igf axis in cancer： epidemiological evidence and potential therapeutic interventions[j]. endocr relat cancer， 2003， 10(4)： 561-578.
furstenberger g， senn hj. insulin-like growth factors and cancer [j]. lancet oncol， 2002， 3(5)： 298-302.
lloret m， lara pc， bordon e， et al. igf-1r expression in localized cervical carcinoma patients treated by radiochemotherapy [j]. gynecologic oncology， 2007， 106(1)： 8-11.
liao y， abel u， grobholz r， et al. up-regulation of insulin-like growth factor axis components in human primary prostate cancer correlates with tumor grade [j]. hum pathol， 2005， 36(11)： 1186-1196.
haydon am， macinnis rj， english dr， et al. physical activity， insulin-like growth factor 1， insulin-like growth factor binding protein 3， and survival from colorectal cancer [j]. gut， 2006， 55(5)： 689-694.
kaulsay kk， ng eh， ji cy， et al. serum igf-binding protein-6 and prostate specific antigen in breast cancer[j]. eur j endocrinol， 1999， 140(2)： 164-168.
cacalano na， le d， paranjpe a， et al. regulation of igfbp6 gene and protein is mediated by the inverse expression and function of c-jun n-terminal kinase (jnk) and nfkappab in a model of oral tumor cells[j]. apoptosis， 2008， 13(12)： 1439-1449.
iwakiri d， sheen ts， chen jy， et al. epstein-barr virus-encoded small rna induces insulin-like growth factor 1 and supports growth of nasopharyngeal carcinoma-derived cell lines [j]. oncogene， 2005， 24(10)： 1767-1773.
zhang pj， weber r， liang hh， et al. growth factors and receptors in juvenile nasopharyngeal angiofibroma and nasal polyps： an immunohistochemical study[j]. arch pathol lab med， 2003， 127(11)： 1480-1484.
