作者：何剑辉 杨国奋， 蔡木炎， 谢丹
【摘要】 【目的】 本研究旨在探讨plc delta1 在上皮性卵巢肿瘤中的表达及其临床意义。【方法】 采用免疫组化方法，检测plc delta1在223例上皮性卵巢肿瘤(183例卵巢癌和对照组40例交界性卵巢肿瘤)组织芯片中的表达;结合患者的临床资料，分析plc delta1的表达与上皮性卵巢癌的关系。【结果】 在有效检测的197例上皮性卵巢肿瘤标本中，大多数(25例，80.6%)交界性肿瘤呈现正常表达，而在卵巢癌中，多数(91例54.8%)肿瘤出现plc delta1的过度表达，两者存在显著差异(p < 0.000 1);而且plc delta1在卵巢癌中表达与肿瘤的临床分期、患者年龄有显著的相关性(p < 0.000 1)。【结论】 plc delta1在卵巢癌组织中的过度表达与肿瘤的恶性进展密切相关，可能是未来检测卵巢癌的一种有价值的新肿瘤标志物。
【关键词】 卵巢肿瘤; plc delta1; 癌基因
abstract： 【objective】 to investigate the expression of plc delta 1 in epithelial ovarian tumor and its clinical significance. 【method】 examination of plc delta 1 expression in the tissue microarray among 223 cases of epithelial ovarian tumor (including 183 cases of ovarian cancer and the control group， 40 of borderline ovarian tumor)， using immunohistochemistry method. subsequent analysis was conducted to reveal the relationship between plc delta 1 expression and the occurrence of epithelial ovarian cancer. 【results】 among 197 valid samples， most of the borderline tumor cases (25 samples， 80.6%) indicated normal expression of plc delta 1; most of the ovarian cancer cases (91 samples， 54.8%)， on the other hand， indicated overexpression of plc delta 1. the study also found a significant difference in plc delta 1 expression (p < 0.000 1) between the two types of cases. also， there is a significant correlation between the plc delta 1 expression in the ovarian cancer cases and their clinical stages， as well as the age of the patients (p < 0.000 1). 【conclusion】 the overexpression of plc delta 1 in the ovarian cancer tissue is closely related to tumor malignancy， suggesting that plc delta 1 could be another effective marker for the diagnosis of ovarian cancer.
卵巢癌是女性生殖器官常见恶性肿瘤，发病年龄以50岁左右为高峰。Www.11665.Com由于卵巢肿瘤发病隐匿，早期诊断困难，大多数(约70%)卵巢癌患者在初诊时已是浸润晚期(figoⅲ或ⅳ期)的肿瘤，其5年生存率不超过30%，死亡率居妇科恶性肿瘤的首位[1]。在我国，卵巢癌的发病呈上升趋势，在一些大城市如上海今年的卵巢癌发病率达6.9/10万[2]，成为危害女性生命健康的主要“杀手”之一。众所周知，卵巢癌的发生发展是一个多基因改变多步骤的复杂过程[3]。因此，卵巢癌密切相关基因的分子致癌机制及其临床肿瘤学意义的深入研究，将对加强和促进卵巢癌的防治工作提供实验研究的基础。目前，越来越多的新基因如runx1、tacc1、deltatap73、clusterin、thy1及ykl-40蛋白等异常已被证实与卵巢癌的发生发展和预后密切相关[4-6]。人类plc delta1基因定位于染色体3p22，包括16个外显子，编码756个氨基酸的蛋白质。plc delta1 是哺乳动物中磷酸肌醇plc大家庭中的一员。plc delta1的表达水平、调节机理和生物学特征已经被广泛研究。但是，该基因在癌症发生、发展中的作用研究很少。国外有学者研究发现，plc delta1与食管鳞癌[7]和结肠癌[8]的恶性进展密切相关。目前，国内外暂时还没有关于plc delta1在上皮性卵巢肿瘤中表达的相关研究。 因此，本研究旨在初步探讨plc delta1 在上皮性卵巢肿瘤中的表达情况及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 材 料
选取1994年至2003年间在中山大学附属第一医院妇产科接受手术治疗的上皮性卵巢肿瘤患者223例(术前均未行放化疗或生物治疗)，收集其临床病理资料。其中卵巢癌患者183例，交界性卵巢肿瘤患者40例。本组上皮性卵巢癌患者的中位年龄为50.5岁，其中浆液性腺癌120例、粘液性腺癌23例、其它类型肿瘤40例;在肿瘤的silverberg氏分级中，36例是g1级卵巢癌、104例为g2级卵巢癌、43例为g3级卵巢癌。临床分期按国际figo分期标准：ⅰ期35例，ⅱ期21例，ⅲ期101例，ⅳ期26例。所有组织标本均再次切片he染色证实诊断。同时选取20例非卵巢疾病(如子宫肿瘤等)手术切除的正常卵巢组织作为实验对照组;标本经40 g/l多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋。
1.2 主要仪器和试剂
仪器：组织芯片制作机为美国nih国家人类基因研究所肿瘤遗传实验室制造。石蜡切片机购自德国leica公司。显微镜及显微摄像装置为日本olympus公司产品。试剂：plc delta1的多克隆抗体购自santa cruz biotechnology， inc
1.3 组织芯片的制作及结果判断
首先在显微镜下对“供体”蜡块的切片选出典型病变部位，然后从“供体”蜡块标本中取出所需组织(每例肿瘤选定2个不同取样位点， 取样确保组织的代表性)，插入“受体”蜡块的洞内，排列成微组织阵列，制成组织芯片蜡块。用切片机对组织芯片蜡块进行连续切片，厚约4 μm，选取石蜡切片作he染色，检查每一点是否与设计阵列中的组织一致。组织芯片石蜡切片作he染色后，对组织芯片阵列中的每一点在显微镜下进行观察与核对，为保证实验结果的可靠性组织芯片中若存在以下情况之一即予剔出：组织定位与取材的偏差导致无效组织过多，有效细胞数过少，缺乏代表性;组织芯片脱片，即制片过程中组织芯的移位或脱落;记录被剔除的组织芯所在阵列，在下一步实验将不列入观察统计。
1.4 免疫组织化学染色
采用免疫组化染色二步法。首先，将制作成的组织芯片脱蜡至水，然后放入3 ml/l h2o2甲醇液中20 min(室温)。接着蒸馏水洗后，放入抗原修复液(ph 6.0)内微波修复20 min。ph 7.2 pbs缓冲液洗3次，滴加正常血清37 ℃，放置20 min;甩去多余血清后，将其放入plc delta1的多克隆抗体中，4 ℃过夜。ph 7.2 pbs缓冲液洗3次后，放入1：200的二抗液体中，37 ℃下放置30 min。ph 7.2 pbs缓冲液洗3次，dab显色5 min，水洗后，苏木素淡染，蓝化，脱水，透明，封固 (图1)。结果观察采用半定量的9分法：按染色的强度，阴性染色记为0分，弱阳性染色1 分，中度阳性 2分，强阳性3分。按阳性细胞数， × 400倍显微镜下每例观察5个视野，每个视野100个细胞，计数染色阳性细胞数，当阳性细胞数少于1%时，为0分;1% ～ 30%为1分;31% ～ 70%为2分;超过70%为3分。将两者的积分相乘(即0 ～ 9分)，记录染色结果。
1.5 统计学方法
采用spss 10.0统计软件进行统计处理。计数资料采用χ2检验。所有检验结果以p < 0.05为有统计学意义。
2 结 果
在本组223例上皮性卵巢肿瘤组织中，有166例卵巢癌标本和31例交界性卵巢肿瘤标本成功地进行了plc delta1免疫组化检测 (17例卵巢癌标本和9例交界性肿瘤标本无效检测的病例因组织芯片取材代表性不足或芯片组织脱落而被剔除)。
因为20例正常卵巢组织均呈plc delta1低水平的表达，根据半定量积分法，表达积分均低于2分(图2)，所以我们定义染色积分小于2分为阴性，正常表达;大于2分则判为阳性，过度表达。
2.1 plc delta1在上皮性卵巢肿瘤中表达情况
plc delta1在卵巢上皮性肿瘤组织中的表达是经免疫组化染色后胞浆内呈现棕黄色颗粒。按半定量的9分法积分标准观察，有效检测的卵巢肿瘤标本中，我们发现plc delta1在卵巢癌组织中的表达明显高于交界性卵巢肿瘤：大多数的交界性卵巢肿瘤(25例，80.3%)表现为plc delta1正常表达(图3);而多数的卵巢癌组织(91例，54.82%)则呈plc delta1的过度表达(图4);两者之间存在显著差异(χ2 = 13.145， p < 0.0001;表1)。
2.2 上皮性卵巢癌中plc delta1表达与临床分期的关系
在对166例成功检测的卵巢癌组织进行进一步分析后，我们发现在不同临床分期的肿瘤中，plc delta1表达有显著差异(χ2 = 11.848，p = 0.008)，plc delta1过度表达率随卵巢癌临床分期的进展而增高(表2)。
2.3 上皮性卵巢癌中plc delta1表达与患者年龄的关系
本组166例上皮性卵巢癌患者的中位年龄为50.5岁，故以51岁为界分为两组。研究发现，在年龄较小的组别(≤50岁)中，有52例(62.7%)呈plc delta1过度表达;在年龄较大的组别( > 50岁)中，有39例(45.5%)呈plc delta1过度表达。两组间存在统计学差异(χ2 = 4.110，p = 0.043)，年龄越小，plc delta1表达越活跃(见表3)。
2.4 上皮性卵巢癌中plc delta1表达与其他临床数据的关系
plc delta1表达与本组患者的组织学分型、病理学分级均未观察到统计学意义的相关性(p > 0.05)。
3 讨 论
人类plc delta1基因定位于染色体3p22，包括16个外显子，编码756个氨基酸的蛋白质。plc delta1 是哺乳动物中磷酸肌醇plc大家庭中的一员，它主要存在于静止期细胞的细胞膜上和胞浆中。plc delta1可以与具有ⅱ型转谷氨酰胺酶(transglutaminas ⅱ， tg ⅱ) 活性的gαh 能够结合并活化[9];另外，rhoa 特异性的p122gtp 酶活化蛋白(p122gap) 也能够活化plc delta1[10];gi/ go蛋白偶联受体激动剂能够通过ca2+介导激活plc delta1[11]。这些激活的plc delta1可以水解小分子的脂质混合物和pip2，同时释放第二信使，如可以使钙离子从细胞内释放出来的ip-3，可以介导pkc激活的二酰基甘油[12-13]，进而将细胞外的信息传递给下游的效应分子，调节生命活动。
在本研究中，我们采用免疫组织化学染色的方法，检测了卵巢肿瘤组织中plc delta1的表达水平。结果发现，plc delta1在卵巢癌的过度表达率明显高于交界性卵巢肿瘤。提示plc delta1在上皮性卵巢肿瘤组织中的表达上调与肿瘤的恶性程度有关。另外，在本组卵巢癌组织中，我们发现plc delta1过度表达率随着卵巢癌的临床分期的进展而增高。这一观察结果提示：plc delta1在卵巢癌组织中的过度表达与肿瘤的恶性进展密切相关，可以作为临床上评估卵巢癌有价值的候选肿瘤标志物。同时，我们还观察到plc delta1的表达与年龄相关：年龄越小表达越活跃。这可能与年轻患者的卵巢组织生长活跃有关。目前，关于plc delta1在肿瘤发生发展中的分子机制还很不清楚。stallings 等[14]研究发现，在真核生物细胞中，抑制plc delta1的表达，可以通过对细胞周期中的cycline的调控，从而抑制细胞的增殖;kaproth-joslin等[15]的研究也表明，plc delta1可以通过激活cyclin e-cdk2活性和增加p27水平，促进细胞周期从g1期进入s期，从而促进细胞的增殖。因此，我们推测：plc delta1在卵巢癌组织中的表达上调，可能通过对细胞周期的调控，从而促进肿瘤细胞的增殖和恶性进展。显然，plc delta1在卵巢癌发生发展中的确切分子机制，尚有待进一步的研究。
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