作者：金鸣锋 何国平 高磊 张寄南
【摘要】 目的： 探讨klotho基因c1818t多态性与中国苏皖地区汉族人群不稳定性心绞痛（unstable angina pectoris, uap）的可能关系。方法： 应用聚合酶链反应（pcr）及基因芯片（gene microarray）方法，检测146例uap患者和235例非冠心病者的klotho基因c1818t多态性。结果： 与对照组相比：(1)uap患者cc，ct和tt基因型以及t等位基因型频率分布差异无统计学意义（p值均＞0.05）；(2)年龄<60岁的uap组tt基因型频率和女性uap组tt基因型，t等位基因频率均明显升高（p值分别为0.017，0.049，0.026）。在调整相关危险因素并经多元logistic回归分析后，tt基因型与女性uap的发生存在相关性（p=0.041），而t等位基因与女性uap的发生无明显关联（p=0.472）。结论： 在中国苏皖地区汉族人群中，klotho基因c1818t多态性tt基因型与女性uap的发病存在相关性。
【关键词】 klotho；基因多态性；不稳定性心绞痛
［abstract］ objective: to investigate the possible association between the klotho gene c1818t polymorphism and unstable angina pectoris (uap)in a chinese han population of suwan region. methods： this study was conducted with a casecontrol design including 146 patients with uap and 235 control subjects who were free from coronary artery disease. the klotho gene polymorphism was determined by polymerase chain reaction and gene microarray. results： compared with the control group, (1)the frequencies of cc，ct，tt genotype and the t allele of the c1818t in uap group was not significantly different; (2)the prevalence of the tt genetype was obveriously higher in younger (age＜60)patients (p=0.017), the frequencies of tt genetype and t allele were also higher in female (p value was 0.049 and 0.026 respectively). furthermore, after adjustment for conventional risk factors by multiple logistic regression analysis showed that the tt genotype was a significant risk factor for uap in the female carrier (p=0.041), but the t allele had no association with uap in female (p=0.472). conclusion： the tt genetype of klotho gene c1818t polymorphism was associated with the susceptibility to uap in the female among the chinese han population of suwan region.
［key words］ klotho; genetic polymorphism; unstable angina pectoris
内皮细胞的凋亡及更替在动脉粥样硬化斑块形成中起着关键的作用［1,2］。WWW.11665.cOmkuroo等［3］发现动脉粥样硬化是klotho基因缺陷鼠的一种表型，对klotho蛋白的研究［4-9］认为它可通过上调血管紧张素转换酶（ace）、调节内皮细胞释放血管内皮生长因子、no等产物及改善血管应激、影响血管紧张度和血栓形成达到抗粥样硬化作用，从而保护心血管系统。以上研究表明klotho基因与动脉粥样硬化存在着重要的联系。虽然目前所知与动脉粥样硬化形成相关的基因已有400个左右，但对动脉粥样硬化候选基因进行的一系列大规模基础研究尚未获得预期结果［10,11］。本研究旨在探讨中国苏皖地区汉族人群klotho基因c1818t多态性分布及其与不稳定型心绞痛（unstable angina pectoris，uap）的相关性。
1 对象与方法
1.1 研究对象
入选病例均选自2003年11月～2007年2月在江苏大学附属武进医院、江苏省人民医院住院患者。选择uap患者（uap组）146例，男117例，女29例，年龄41～84（平均65.82±9.47）岁，均符合2002年aha/acc关于uap诊断指南的诊断标准。对照组为经相关检查排除冠心病者235例，其中男138例，女97例，年龄36～84（平均61.58±10.93）岁，大部分经冠状动脉造影证实冠状动脉主支无狭窄或狭窄直径小于50%。所有研究对象均为中国苏皖地区汉族人。
1.2 方法
1.2.1 聚合酶链反应（pcr） 酚氯仿法提取白细胞基因组dna。由takara公司合成引物，上游引物：5′gaatgtttacctgtgggatg3′，下游引物：5′丙烯酰胺tgtggttcacctgggact 3′，预计pcr扩增产物片段长度为209 bp。反应体系：10×缓冲液5 μl，mg2+终浓度为2.0 mmol/l，4种dntp终浓度为0.2 mmol/l，上下游引物各5 pmol，taq dna酶1.25 u（takara），模板dna 100 ng。反应条件：94℃ 5 min，然后94℃ 48 s，58℃ 40 s，72℃ 55 s进行37个循环，72℃延伸5 min。取pcr产物5 μl采用琼脂糖凝胶-溴化乙啶法进行电泳（图1），uvi自动凝胶成像分析系统观察并结合dna分子量标准及测序方法（大连宝生物公司）判断是否为预期的目的片段。
m: dl2000 标准参照物 (takara)；1～8: pcr产物电泳条带
图1 klotho基因c1818t多态性pcr产物电泳图（略）
fig 1 electrophoretic image of pcr protector klotho gene c1818t polymorphism
1.2.2 基因芯片制备 冰异丙醇沉淀pcr产物，12 000 r/m离心45 min后37℃烘干备用，同时制备玻片（sigma公司）；取上述纯化产物，加18 μl点样液溶解，0℃保存20 min；将上述混合液置于384微孔板中，放入smartarrayer48（晶芯，博奥生物公司）点样仪并在玻片上完成全部点样；点样后，玻片在temed中真空干燥1 h，然后按序置于0.1×naoh缓冲液变性10 min，1×tbe缓冲液电泳10 min；取等量5′cy3 atgcacgttacacatt, 5′cy5aaatgcatgttacacatt单核苷酸探针，与杂交液1:3稀释后，在37 ℃下与点有样品的玻片杂交3 h后置于冰冷的1×tbe缓冲液中电泳10 min。
1.2.3 基因型判断 用capitalbiotm扫描仪（晶芯，博奥生物公司）对杂交后的玻片进行扫描，并根据cy5/cy3比值判断基因型（图2）。
1.2.4 生化指标测定 采用全自动生化分析仪（奥林巴斯公司）测定三酰甘油（tg）、低密度脂蛋白（ldl）、高密度脂蛋白（hdl）和血糖（glu）等指标。
1.3 统计学分析
计量资料结果以±s表示，采用t检验，研究对象组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，应用多元logistic回归分析基因型与uap的相关性，关联程度用优势比（odds ratio, or）和95%可信区间（confidence interval, ci）表示。所有资料均采用spss 13.0软件进行分析，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 uap组与对照组临床资料分析
两研究组收缩压（sbp），舒张压（dbp），glu，tg，ldl水平差异无统计学意义；uap组年龄、男性性别比及吸烟比例明显高于对照组，而hdl水平明显低于对照组（表1）。
表1 两组基本资料比较（略）
tab 1 baseline characteristics in two groups
2.2 klotho基因型分析及dna序列测定
第四外显子c1818t多态性pcr扩增产物为209 bp的片段（图1），采用基因芯片方法判断基因型，本研究检测到3种基因型：红色为tt基因型；黄色为ct基因型；绿色为cc基因型（图2）。并抽取部分pcr产物经测序验证其基因型（图3）。
2.3 klotho基因多态性分布
与对照组相比：(1)uap组cc，ct，tt基因型及t等位基因频率差异无统计学意义（表2，p>0.05）；(2)亚组分析：女性uap患者的tt基因型（p=0.049）及t等位基因（p=0.026）频率、非老年（＜60岁）uap患者tt基因型频率（p=0.017）均明显升高（表3，4）；老年（≥60岁）、男性uap患者cc，ct，tt基因型和t等位基因频率与非老年uap患者cc，ct基因型和t等位基因频率及女性cc，ct基因型频率差异均无统计学意义（表3，4）。
表2 klotho基因c1818t多态性分布（略）
tab 2 genotype distribution and allele prevalene of klotho gene c1818t polymorphisms
表3 不同年龄组klotho基因c1818t多态性分布（略）
tab 3 genotype distribution and allele prevalene of klotho gene c1818t polymorphisms in different age populations
表4 不同性别研究对象klotho基因c1818t多态性分布（略）
tab 4 genotype distribution and allele prevalene of klotho polymorphisms in different sexual populations
2.4 klotho基因tt基因型和t等位基因与女性uap患者的关系
在调整吸烟、年龄，sbp，dbp，glu，tg，ldl，hdl等危险因素并经logistic回归分析后，tt基因型与女性uap存在相关关系（p=0.047，表5），而t等位基因与女性uap无明显相关关系（p=0.472，表6）。
表5 klotho基因c1818t多态性tt基因型与女性uap患者的关系（略）
tab 5 unadjusted and adjusted odds ratios for the association between tt genotype of the c1818t polymorphism and cases in female
* ：为调整吸烟、年龄，sbp，dbp，glu，tg及ldl等危险因素并经logistic回归分析的or值，95%ci及p值
表6 klotho基因多态性t等位基因与女性uap患者的关系（略）
tab 6 unadjusted and adjusted odds ratios for the association between t allele of the c1818t polymorphism and cases in female
*：为调整吸烟、年龄，sbp，dbp，glu，tg及ldl等危险因素并经logistic回归分析的or值，95%ci及p值
3 讨论
klotho基因位于染色体13q12区域，全长约为50 kb，由5个外显子和4个内含子组成。该基因编码两种蛋白，一种为含有1 014个氨基酸的跨膜蛋白，其膜外段含有两个重复序列，与细菌、植物的β葡萄糖苷酶存在20%～40 %的同源性，且含有一段lyslysarglys的碱性氨基酸序列，该处可被裂解,释放出小片段肽链进入体液循环发挥作用［12］；另一种为含有549个氨基酸的分泌性蛋白。klotho基因缺陷小鼠依赖乙酰胆碱的主动脉舒张功能较野生型明显下降，其内皮源性no较野生型生成减少［5，13］。在运用腺病毒将klotho基因转入具有多种动脉粥样硬化危险因素的大鼠后，可以增加内皮细胞no合成，且具有减轻动脉粥样硬化的作用［13］。kuwahara等［6］的研究发现klotho基因具有抗动脉粥样硬化作用，在抗氧化亚氮合酶（nos）抑制剂处理后，粥样硬化的进程减慢。研究发现［4］klotho基因缺失的老鼠血浆中1型纤溶酶原激活物抑制剂（pai1）明显增高。pai1的表达增加，引起血栓形成的几率也随之增加，这预示着klotho基因与血栓的形成存在密切联系。
klotho基因第四外显子c1818t多态性t等位基因频率在韩国冠心病（cad）人群中为0.172［14］，本研究发现，冠心病中的uap患者为0.178（表2），两组结果相近。由此提示，在两国冠心病或uap人群中，t等位基因出现的频率相似。另外，rhee等［14］研究发现，t等位基因（包括ct，tt基因型）携带者冠心病患病率（47.1%)较cc基因型携带者（60.6%)低(p=0.036），特别是小于60岁的t等位基因（包括ct，tt基因型）携带者较cc基因型携带者的冠心病患病率低（p=0.025），他们认为c1818t多态性cc基因型可能是早发冠心病的易感基因型。本研究发现，女性uap患者的tt基因型（p=0.049）及t等位基因（p=0.026）频率、非老年（＜60岁）uap患者tt基因型频率（p=0.017）均明显升高（表3，4）。经logistic回归分析后显示tt基因型与女性uap的发生存在相关性（表5）。由于在年龄<60岁的对照组中并没有发现tt基因型，所以tt基因型是否与年龄<60岁的uap存在相关性，尚不能定论。
综上所述，本研究结果提示，在中国苏皖地区汉族人群中，klotho基因c1818t多态性tt基因型与女性uap的易感性有关，不管是否存在uap发病的其他危险因素，携带该基因型的女性有发生uap的潜在性；携带t等位基因的女性有发生uap的倾向，但只有同时存在uap发病的其他危险因素时才有发病的可能性。klotho基因广泛的生物学效应，决定了它不仅在调控衰老的过程中有着重要地位，而且与众多疾病，特别是冠心病及其特殊类型uap的发病有着密切联系。我们对klotho基因多态性与uap相关性的研究结果在国内外属首次报道，为uap患者的基因学研究和一级康复干预补充了实验室数据，为进一步阐明uap发生的遗传背景和机制提供了一些线索，进一步补充了冠状动脉疾病基因klotho单核苷酸多态性的数据库信息。当然，klotho基因第四外显子c1818t多态性与uap的确切关系及具体机制还有待于深入研究。
近年来，有研究推测一些基因变异可以用来预测cad/acs，但所得结果很多不能够被重复。本研究与国外研究所得出的结论也不尽相同，分析其原因，首先，最大可能与被研究人群的地区和种族差异以及冠心病的类型不同有关。其次，研究对象不完全一致，比如，本研究对象为冠心病中的uap，而不是所有类型冠心病患者；再者，配对设计的方法不同和样本量偏小等原因也会引起研究结果的不一致。而且klotho基因变异对cad/uap的作用可能与环境因素和其他基因的交互作用有关。所以，虽然有些研究揭示klotho基因所表达的蛋白在调控动脉内皮细胞no和pai1的生成、血管紧张素ⅱ介导的血管损害以及血栓形成、斑块破裂等方面起着重要作用，或该蛋白的代谢产物具有拮抗粥样硬化作用，但klotho基因多态性使动脉粥样斑块不稳定的机制尚不清楚。
本研究的局限性：(1)样本量相对较小，对统计学结果会产生一定影响；(2)对照组部分未行冠脉造影，仅以无胸痛和心电图正常等为排除uap的标准，其中可能有无症状性uap患者；(3)对于c1818t多态性与冠状动脉狭窄严重程度和冠状动脉病变范围（支数）之间的关系未进行研究；(4)行冠脉造影者以冠状动脉主支无狭窄或狭窄直径小于50%为入选标准，而冠脉狭窄直径<50%者将来有可能进展为uap；(5)所入选的研究对象尚存活于世，存活偏倚不可避免，且未对c1818t多态性与uap、患者生存率进行随访。因此klotho基因c1818t多态性与uap的确切关系以及与uap预后、生存率的关系还有待于下一步的研究。
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