作者：杨媛媛，邹敏书 余健 聂国明 罗莉漫 徐洪涛 赵林双 何威逊
【摘要】 目的：观察ezrin蛋白在糖尿病肾病(dn)大鼠肾小球的表达以及活性维生素d[ 1,25(oh)2d3]对其表达的影响。方法:wistar大鼠随机分为对照组和糖尿病肾病模型组;后者经腹腔注射链佐脲菌素(stz)诱导dn大鼠模型，再随机分dn组和1,25(oh)2d3组。1,25(oh)2d3组皮下埋置渗透性微量泵，给予1,25(oh)2d3 0.03 ng/g·d-1，连用8周。检测大鼠血糖(glu)、肾重/体重(kw/bw)、24 h尿蛋白(24 h up)、血肌酐(scr)、尿足细胞(upc)。采用间接免疫荧光检测肾小球ezrin蛋白的表达与分布。wt1免疫组化染色检测每个肾小球足细胞数目。结果：与对照组相比，dn组glu、kw/bw、24 h up、scr、upc显著升高;肾小球ezrin表达显著下降，足细胞数目减少。dn组与1,25(oh)2d3组glu水平无显著性差异，1,25(oh)2d3组kw/bw、24 h up、scr、upc较dn组显著降低;而肾小球ezrin表达及足细胞数目显著增加。对照组ezrin蛋白荧光染色沿肾小球毛细血管壁均匀线型分布;dn组呈不连续的粗颗粒样分布;1,25(oh)2d3组部分呈短线型荧光。ezrin表达荧光强度与肾小球足细胞数目呈正相关(rs=0.51，p<0.01)，与24 h up、upc呈负相关(rs=0.43，0.45，p<0.01)。WWw.11665.cOm结论：1,25(oh)2d3可减少dn鼠肾小球ezrin的表达，减少足细胞脱落，维持肾小球足细胞数量。
【关键词】 足细胞;活性维生素d;ezrin;糖尿病肾病;大鼠
[abstract] objective: to observe the effect of 1,25dihydroxyvitamin d3(1,25(oh)2d3) on the expression of ezrin in glomeruli of rats with diabetic nephropathy(dn). methods: wistar rats were randomly divided into two groups: control group and dn model group which was induced by peritoneal injection of streptozotocin(stz). after these models were successfully established, they were randomly divided into two groups: dn group and 1,25(oh)2d3 group. 1,25(oh)2d3 group was embedded with the osmotic minipump for giving 0.03 ng/g-1·d-1 1,25(oh)2d3 for 8 weeks. blood glucose(glu), the ratio of kidney weight/body weight(kw/bw), 24hour urinary protein(24 hup), serum creatinine(scr) and urinary podoctye(upc) were measured. the expression and distribution of ezrin in glomeruli was detected by indirect immunofluorescence. podocyte number per glomeruli was determined by wt1 immunohistochemistry. results: compared with control group, the level of glu, kw/bw, 24 hup, scr, upc in dn group were significantly increased. the expression of ezrin in glomeruli statistically decreased. average numbers of podocytes per glomeruli was dramatically reduced. there was no significant difference of glu between dn and 1,25(oh)2d3 group. kw/bw, 24 hup, scr, upc were significantly lower in 1,25(oh)2d3 group than in dn group. the expression of ezrin and the numbers of podocytes per glomeruli in 1,25(oh)2d3 group were higher than those in dn group. in control group, fluorescent staining of ezrin was detected as a fine, linearlike pattern along the glomerular capillary loop; ezrin staining changed to a discontinuous, coarse granular pattern in dn rats, short linear pattern was observed in part of the glomeruli in 1,25(oh)2d3 group. fluorescence intensity of ezrin showed a positive correlation with the numbers of podocytes per glomeruli (rs =0.51, p<0.01),and a negative correlation with 24 hup,upc(rs =0.43,0.45, p<0.01). conclusions: 1, 25(oh)2d3 could contribute to increasing ezrin expression in dn rats, reduce podocyte detachment to preserve podocyte number.
[key words] podocyte; 1, 25(oh)2d3; ezrin; diabetic nephropathy; rat
肾小球脏层上皮细胞足细胞(podocyte, pc)是位于肾小球基底膜(gbm)外侧的终末分化细胞，构成肾小球滤过膜上机械屏障和电荷屏障的重要组成部分，其紧贴于肾小球基底膜(gbm)外侧。因此，pc损伤、脱落是蛋白尿发生的病理基础之一。近年来，pc内部结构的特殊蛋白成为研究的热点。podocalyxin(pcx)、钠氢交换调节因子2(nherf2)、ezrin分布于pc足突顶部，三者构成pcx/nherf2/ezrin复合体参与了pc生理和病理的发生机制，其中pcx是维持负电荷屏障和保持足细胞形态的重要分子，它通过nherf2/erzin与肌动蛋白骨架αactinin4连接，维持pc结构稳定[1]。ezrin参与pc形态的维持、运动、黏附，并与pc生存有关。活性维生素d[1,25(oh)2d3]是临床上常用的药物，其可减少pc脱落，多途径保护肾脏[2]。而其对ezrin蛋白表达的影响作用不明。本文在dn模型鼠上观察1,25(oh)2d3对ezrin表达及pc排泄的影响，探讨对其肾保护作用的机制。
1 材料与方法
1.1 糖尿病肾病大鼠的建立及分组
健康雄性wistar大鼠，体质量200～250 g，由广州军区武汉总医院实验动物中心提供。动物室温度25 ℃，湿度70%，12 h交替照明，大鼠自由饮水、进食。一次性腹腔注射链脲菌素(stz)65 mg/kg(美国sigma公司生产，用0.1 mol/l、ph 4.5的柠檬酸缓冲液配成2%的溶液)以诱导dn大鼠模型，3 d后测血糖，血糖≥16.7 mmol/l确认为dm大鼠模型制备成功，继续喂养，3周后用双缩脲法测定尿蛋白定量≥30 mg/24 h时，确认dn模型制备成功，将20只诱导成功的dn大鼠随机分两组：(1)dn组(n=10);(2) 1,25(oh)2d3组(n=10)，埋植渗透性微量泵按0.03 ng/g·d-1皮下给予1,25(oh)2d3[3]，连用8周。对照组(n=10)及dn组皮下给予等体积的蒸馏水。给予1,25(oh)2d3 8周抽血查餐后2 h血糖(glu)、血清肌酐(scr)，代谢笼收集24 h尿液，检测24 h尿蛋白(24 h up)及尿液足细胞(upc);然后处死大鼠，取出双肾，计算双肾与体重之比，后肾小球免疫组化及免疫荧光染色。
1.2 24 h up、upc检测
24 h up用考马斯亮蓝比色法测定。upc检测按邹敏书等报道[4]的方法进行，以间接免疫荧光方法检测肾小球足细胞特异性核心蛋白wt1，沉渣涂片wt1阳性的细胞即为pc。方法如下：收集大鼠24 h尿液，沉渣离心甩片，离心5 min，抽出上清后，尿沉渣用0.01 mol/l pbs洗涤沉淀，溶于10 ml pbs，离心5 min，将尿沉渣置于经过多聚赖氨酸包被处理的玻片上，玻片空气干燥30 min ，4 °c 丙酮固定5 min，滴加小鼠抗wt1抗体在室温条件下与足细胞特异性标志wt1结合1 h，pbs洗涤，加入异硫氰酸荧光素(fitc)标记山羊抗小鼠抗体igg进行染色，在37 ℃温育30 min，洗涤，洗净后，在荧光显微镜下观察尿沉渣涂片中wt1染色阳性细胞即为pc。随机选择20个高倍视野观察尿沉渣涂片中的wt1阳性细胞，结果用每个视野平均wt1阳性细胞数表示。小鼠抗wt1单克隆抗体购自美国neomarkers公司，fitc标记山羊抗小鼠二抗购自中山公司。
1.3 免疫组化检测肾小球足细胞数量
3 μm厚的肾组织切片常规处理，pas染色，在普通光学显微镜下观察肾组织的病理变化。肾组织wt1免疫组化染色定量测定肾小球pc数目，wt1阳性细胞即为足细胞[5]，操作按说明。以pbs替代一抗。每只鼠随机选择20个肾小球在高倍镜下(×400)计数pc数目，取平均值表示每个肾小球pc数量。
1.4 间接免疫荧光检测肾小球ezrin蛋白的表达
肾组织经常规石蜡包埋，切取3 μm石蜡切片，微波抗原修复，小鼠抗ezrin单克隆抗体(1∶50稀释，福建迈新生物技术开发公司)，4 ℃孵育过夜，pbs洗涤，fitc标记的羊抗小鼠igg抗体，室温孵育40 min，pbs洗涤，封片，以pbs代替一抗为阴性对照。结果采用荧光显微镜(上海宙山精密光学仪器有限化司)观察。利用laserpix4.0分析软件，在每一例切片上随机分别测量10个肾小球面积和每个肾小球内ezrin阳性区域所占的面积，计算出每个肾小球内ezrin阳性区域所占肾小球面积的比值，取其平均值。
1.5 统计学处理
所有数据用(±s)表示，用spss 11.0统计软件完成，先进行方差齐性检验，方差齐时，多组比较用oneway anoa lsd方差分析;方差不齐，多组比较kruskalwallis h秩和检验，有显著性差异时，两组比较用mannwhitney utest。相关分析用spearman等级相关分析法，p<0.05 具有统计学意义。
2 结果
3组大鼠glu、kw/bw、24 h up、 scr、 upc检测结果比较见表1。
3组大鼠肾小球ezrin的荧光表达强度及每个肾小球足细胞数目见表2。表1 3组大鼠glu、kw/bw、 24 h up、 scr、 upc比较注：与对照组相比，▲▲p<0.01;与dn组相比，##p<0.01，#p<0.05。表2 肾小球内ezrin表达荧光强度及每个肾小球足细胞数目的比较注：与对照组相比，▲▲p<0.01;与dn组相比，##p<0.01。
3组大鼠肾球ezrin的荧光分布及wt1免疫组化 ezrin表达呈现绿色荧光: 对照组沿肾小球基底膜呈线型方式表达;dn组呈粗颗粒样不连续分布，节段性缺失明显;1,25(oh)2d3组线型表达稍模糊，表达缺失较轻。肾小球wt1免疫组化示wt1阳性细胞即pc呈现深蓝色，靠近肾小球基底膜分布：对照组pc染色分布均匀，数目多;dn组pc明显减少;1,25(oh)2d3组pc数目较对照组稍减少，较dn组明显较多。
ezrin表达与其他指标的相关性分析：ezrin表达荧光强度与肾小球pc数目呈正相关，rs为0.51，p<0.01;与24 h up、upc呈负相关，rs分别为为-0.43，-0.45，p<0.01;与glu、kw/bw、scr无相关性，rs分别0.12、0.22、0.25，p>0.05。
3 讨论
ezrin蛋白是一种将细胞骨架与细胞膜连接起来的特定蛋白，是erm蛋白(ezrin，radixin，moesin)家族的一员，为细胞内蛋白，通过氨基端与细胞膜相连，羧基端与肌动蛋白细胞骨架相连，成为膜细胞骨架的连接子。exrin作为pc的标志蛋白之一，其一端与pc顶膜区表面覆盖一层负电荷的涎粘蛋白pcx及nherf2相连，另一端与肌动蛋白相连，对维持负电荷和保持pc形态起重要作用。ostalskanowicka等[6]报道，从微小病变(mcd)、弥散性肾小球系膜增生(dmp)到局灶节段性肾小球硬化(fsgs)病例中，免疫组化显示pcezrin的表达进行性减少;ezrin是pc损伤的有效标志，在激素抵抗和以蛋白尿为主要表现的肾小球疾病中，ezrin表达减少导致滤过屏障通透性增加。lai等[7]报道，iga患者肾小球exrin免疫染色显著减弱，exrin mrna 表达与蛋白尿与肌酐清除率相关;单用抗tnfα或tgfβ抗体可部分恢复exrin的表达，2种抗体联用可完全恢复exrin的表达。本文结果表明，ezrin表达与肾小球pc数目呈正相关，与尿蛋白及尿pc排泄呈负相关。表明ezrin正常表达对防止pc脱落，维持肾小球pc数目，减轻蛋白尿起重要作用。pc损伤脱落，肾小球pc数量减少，不仅可引起蛋白尿，且有报道，尿液中脱落pc数量较尿蛋白更加敏感地反映进展性肾小球损伤[8]。
1,25(oh)2d3是临床中常用的药物，对肾脏的保护作用初现端倪:减少pc丢失及肥大;通过抑制肾素生成，下调肾素血管紧张素系统(ras)系统;降低慢性肾疾病(chd)蛋白尿;降低纤维细胞因子tgfβ的生成[9]。但对pc保护作用机制尚不明确。kuhlmann[3]报道1,25(oh)2d3可减少肾大部分切除鼠pc肥大及丢失，进而减轻蛋白尿及肾小球硬化。schwarz等[10]发现给大部分肾切除大鼠服用1,25(oh)2d3后，肾小球硬化指数和尿白蛋白排泄均减少，tgfβ1表达显著减少，肾小球损伤进展得到减缓。本文结果显示，1,25(oh)2d3能减轻dn鼠尿蛋白、尿pc的排泄，降低血肌酐，维持肾小球pc的数目;同时可增加肾小球ezrin的表达，减少其分布异常。因此，1,25(oh)2d3的pc保护作用部分可能增加ezrin的表达，减少其异位分布，维持了pc的数目及结构，从而减少了尿蛋白的滤出。其对pc的作用不依赖于对钙磷代谢的影响。
总之，1,25(oh)2d3能上调肾小球ezrin的表达，减少pc脱落，维持肾小球pc的数目，其pc保护作用可能与增加ezrin的表达，减少其分布异位有关。
【参考文献】
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4 邹敏书,何威逊,余 健,等.1,25(oh)2d3对局灶节段性肾小球硬化大鼠尿pc排泄及肾小球wt1分布的影响[j].临床儿科杂志,2008,26(4):291294.
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