【摘要】 目的：克隆并分析保加利亚德氏乳杆菌中的乳糖酶基因。方法：利用pcr技术从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出乳糖酶基因、测序并生物信息学分析。结果：成功的从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出全长为3 024 bp的乳糖酶基因，利用生物软件分析，推测乳糖酶基因共编码1 008个氨基酸，蛋白分子量为114 kda，等电点为4.9，氨基酸序列中共有9处潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行同源性比较。结论：成功的克隆出乳糖酶基因，并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征，为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。
【关键词】 乳糖酶基因；克隆；生物信息学分析
［abstract］ objective: to clone and analyze lactase gene from lactobacillus delbrueckii bulgaricus. methods: cloned lactase gene from lactobacillus delbrueckii bulgaricus with pcr, made sequencing and bioinformatics analysis. results: cloned lactase gene (3 024 bp) successfully. it was presumed that the lactase gene encode 1 008 amino acids, with protein molecule 114 kda, isoelectric point 4.9, 9 potential glycosylation sites in amino acid sequence. made homology comparison with other lacteses. conclusion: the lactase gene is cloned successfully and the bioinformatics analysis is made by biological analysis software to investigate its character. it provides foundation for further study and colonization at low cost.
［key words］ lactase gene; clone; bioinformatics analysis
乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质，还含有免疫球蛋白等抗病因子，易被人体消化吸收，是人类改善营养、增强体质的理想食品［1］。wWw.11665.CoM除此之外，在牛乳等制品当中还含有5%左右的乳糖,它是牛奶中主要的碳水化合物，对人体有着重要的作用。主要表现在于乳糖能促进钙质吸收及整理肠道的功效，特别是乳糖被分解后的半乳糖是婴儿脑发育的必需物质，与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。然而，人体却不能直接利用乳糖，它必须被乳糖酶分解为单糖的葡萄糖及半乳糖后才能被吸收和利用。据研究发现，世界各国人口都有不同程度的乳糖酶缺乏，东方人乳糖酶缺乏高达85%［2］，从而导致“乳糖不耐症”的发生。
乳糖酶(ec3．2．1．23，又名β半乳糖苷酶)能将牛乳中的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，并具有半乳糖苷的转移作用［3］。利用该酶生产低乳糖制品或口服酶制剂，能够有效解决“乳糖不耐症”问题。乳糖酶广泛存在于扁桃、桃、杏、苹果和咖啡豆等植物中，大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和霉菌等微生物中，以及有效哺乳动物的小肠等器官和皮肤组织中。然而，不同来源的乳糖酶，其酶学性质相差很大。本研究从保加利亚德氏乳杆菌中成功的克隆出乳糖酶基因，并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征，为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 保加利亚德氏乳杆菌购买于广东省微生物研究所菌种保藏中心；大肠杆菌dh5α由本室保存；pgmt vector购于北京天根生化科技有限公司。
1.1.2 试剂材料 细菌培养试剂购于sigma公司；引物由上海生工合成；la dna聚合酶购于自大连宝生物公司；细菌基因组提取试剂盒、dna胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、dna ladder购于北京天根生化科技有限公司；t4连接酶、琼脂糖、荧光染料由本室保存。
1.2 方法
1.2.1 保加利亚德氏乳杆菌基因组dna的提取
用灭菌双蒸水溶解干冻管里的保加利亚德氏乳杆菌，并划平板到mrs固体培养基，37 ℃培养72 h，挑取单个菌落于mrs液体培养基进行增菌（37 ℃摇床）。利用细菌基因组提取试剂盒提取保加利亚德氏乳杆菌基因组dna，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测纯度。
1.2.2 引物设计与合成 从genbank数据库中检索到保加利亚德氏乳杆菌中乳糖酶基因序列（genbank序列号：gi149564）设计引物如下：p1：5'5' cgcggatccgcgatg agc aa taagtta3'；p2：5'ccgctcgagcggttattttagtaaaaggg3'。上述引物由大连宝生物工程有限公司合成(下划线碱基分别为bamh i和xho i酶切位点)。
1.2.3 乳糖酶基因的pcr扩增与鉴定 反应总体积为25 μl：模板dna(1 μg/μl) 3 μl，10×buffer2.5 μl,mg2+( 25 mm)2.0 μl, dntp(2．5 mm)2.5 μl,引物p1(10 pmol／μl) 0.4 μl,引物p2 (10 pmol／μl)0.4 μl,la dna聚合酶(5 u/ul)0.2 μl,双蒸水14 μl；反应条件：98 ℃，1 min;94 ℃,30 sec;50 ℃,30 sec;72 ℃,4 min; 30个循环；72 ℃，5 min.然后用1％ 的琼脂糖凝胶电泳检测，同时加上500 bp ladder对pcr产物进行初步鉴定。
1.2.4 乳糖酶基因的克隆与鉴定 pcr扩增出目的基因，1%琼脂糖电泳，切胶后用dna胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化的pcr产物与pgmt vector进行连接（4 ℃，24 h），转入新制备［4］的感受态大肠杆菌dh5α，再涂于含氨苄青霉素的lb培养基上37 ℃培养过夜，用接种针分别挑取仅有的4个菌落于含氨苄青霉素的lb液体培养基上增菌培养（做好标记）。采用小量质粒提取试剂盒分别对4管菌液提取质粒。采用三酶切(bamh i、xho i和pvu i)和pcr两种方法对重组子进行鉴定。经鉴定的阳性重组质粒由北京天根生化科技有限公司测序。
1.2.5 乳糖酶基因序列的生物信息学分析 利用生物软件dnassist version2.0对该序列进行物理化学性质的分析，推测其氨基酸序列。利用在线分析软件sopma对其进行二级结构分析以及在线分析软件netnglyc1.0进行蛋白质功能位点预测。并利用在线分析软件blast在genbank 数据库中进行同源性分析［5］。并利用dnaman软件绘制其同源关系图。
2 结果与分析
2.1 乳糖酶基因克隆与鉴定
用细菌基因组提取试剂盒提取保加利亚德氏乳杆菌基因组dna，1%琼脂糖凝胶电泳，可见到清晰的条带，说明获得高质量的基因组dna。以该基因组dna为模板，进行目的基因的pcr扩增，结果可扩出3 024 bp的目的片段。将该目的基因片段进行胶回收纯化后，与pgmt vector进行连接，转化感受态大肠杆菌dh5α，通过氨苄青霉素筛选，得到4个菌落，4个菌落分别在含有氨苄青霉素的lb液体培养基上增菌培养，采用小量质粒提取试剂盒分别对4管菌液提取质粒。pcr及酶切（如图1）所得质粒，电泳结果发现第3号质粒成功地被三酶切，得到3 024 bp的目的基因，初步证明包含乳糖酶dna的重组质粒pgmtlacz构建成功。注：1、2、3、4号为质粒三酶切，5号为500 bp ladder
2.2 测序结果及生物信息学分析
序列测定证明．构建的重组载体中含有乳糖酶全长编码序列，经blast同源性分析，与genbank中登录的序列完全一致。利用生物软件dnassist 2.0对已克隆基因进行分析，其结果推测出肽链具有1 008个氨基酸，该蛋白分子量为114kda，等电点为4.9。利用在线分析软件sopma对其蛋白序列进行二级结构分析，结果发现该蛋白氨基酸序列中有205个氨基酸组成α螺旋，占氨基酸总数的20.34%；64个氨基酸组成β折叠，占总数的6.35%；489个氨基酸随意缠绕，占总数的48.51%；250个氨基酸组成扩展链，占总数的24.8%（如图2）。蓝条带代表α-螺旋的位置；绿条带代表β-折叠的位置 利用在线分析软件netnglyc1.0对该蛋白功能位点进行预测，结果发现该蛋白序列共有9处潜在糖基化位点：nasf258、nqsl389、nesy464、nsss635、nesy878、nfsp900、nrsk912、nlsa938、nytw961。
2.3 乳糖酶基因同源性比较
将本实验已克隆出的乳糖酶基因翻译成氨基酸序列，通过在线分析软件blast与genbank 数据库中含有乳糖酶基因的氨基酸序列进行同源性比较，结果发现与乳糖分解酵素的同源性高达到99%，而其他却较低，分别是链球菌49%；乳酸菌46%；酪酸梭状芽胞杆菌45%；产气荚膜梭菌45%；长双歧杆菌45%。利用dnaman软件对同源性比较所得结果进行同源关系图的绘制（如图3）。
3 讨论
乳糖是牛奶中主要的碳水化合物，全脂牛奶中约30％的热量和脱脂牛奶中60％的热量都是由乳糖提供。然而对于“乳糖不耐症”的人群来讲，无法充分利用这种能量，一旦身体的能量需求不能得到满足(营养不良的儿童)，蛋白质就仅被用于满足能量需要，而不能作为构成人体蛋白的单元。除此之外，乳糖还是矿物质成分的载体，可促进矿物质元素的吸收。因此，假如乳糖不被吸收，它将被排放到肠中被肠道微生物发酵产酸产气，从而导致胃肠功能失调，并造成有价值的蛋白质和矿物质的损失，如铁、锌、钙质的丢失，这与小儿佝偻病和成年人的骨质疏松症都有着密切的关系。然而，乳糖是一种双糖，因为分子太大，不能被人体直接吸收，需要被小肠中的乳糖酶分解为葡萄糖和半乳糖，然后再被人体吸收［6，7］。
据研究发现，随着人类的生长发育，体内乳糖酶活性却呈规律性衰减，其中我国就有75%～95%［8］，最终造成“乳糖不耐症”的发生。由此可见，人体不断补充乳糖酶至关重要。当今乳糖酶广泛应用于食品行业，特别是乳品行业，需求量逐年增加。然而，国内大量的乳糖酶的需求都基本须来自于进口，价格昂贵，因此，研发出一套能够低成本生产乳糖酶的方法迫在眉睫。本研究通过保加利亚德氏乳杆菌，成功的克隆出乳糖酶基因。并利用生物软件对其进行生物信息学分析，了解该酶的理化性质，为下一步表达及制作口服片剂奠定基础。并通过二级结构及糖基化位点的预测为今后对该酶的进一步研究和应用提供很好的数据平台。
【参考文献】
1 许牡丹，范金波，檀志芬，等．米曲氍β半乳糖苷酶的纯化与性质研究［j］．陕西科技大学学报，2003，2l(4):1316．
2 calloway dh， colassito dj, mathens rd. gases produced by human intestinal microflora［j］. nature, 1966, 212:12381239.
3 高焕春．乳糖酶的特性及其在乳品工业中的应用［j］．中国乳品工业，1996，24(3):1921．
4 sambrook joseph sambrook, t.maniatis. eds.2nd ed．molecular cloning: a laboratory manual［m］．new york:cold sping harbour laboratory press,1989.10．
5 altschul sf, madden tl, schaffer aa, et al. gapped blast and psiblast: a new generation of protein database searchprograms［j］. nucleic acids res, 1997,25(17):33893402.
6 bernard cochet. effects of lactase intestinal calcium absorption in normal and lactasedeficient subjects ［j］. gastroenterology,1983,84:935．
7 adriana n.verification of the lactate site of rat lactase phlorizn hydrolase by sitedirected mutagenesis ［j］.gaetroerology,1995, 109:1234．
8 李淑娟，郭润芳，于宏伟，等.aspergillus niger乳糖酶基因的克隆及序列分析［j］.中国农学通报，2007，23（6）：187190.
