何首乌饮对d半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺ngf、egf表达的影响
【关键词】 何首乌饮;衰老大鼠;下颌下腺;ngf;egf
【摘要】 目的 观察何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺神经生长因子(ngf)、表皮生长因子(egf)表达的影响。方法 选用8周龄sd雌性大鼠，随机分为正常组、模型组及何首乌饮干预预防组和治疗组，用sp免疫组化法检测下颌下腺ngf、egf表达的改变。结果 预防性实验各组间ngf、egf表达均以正常组最高，模型组最低，且中剂量预防组效果最好(p<0.01)。治疗性实验各组间ngf、egf表达均以正常组最高，自然恢复组最低，且中剂量治疗组最高(p<0.01)。结论 何首乌饮可提高下颌下腺ngf、egf的表达而达到延缓衰老的作用。
【关键词】 何首乌饮;衰老大鼠;下颌下腺;ngf;egf
【abstract】 objective to observe the effects of heshouwuyin on the expressions of egf and egf mrna in submandibular glands of aging rats. methods dgalactose senescence model was adopted. the effects of heshouwuyi were divided into two parts: preventive experiment and treatment experiment. sp immunohistochemistry was applied to observe the expression changes of egf and in site hybridization method was used to observe the expression changes of egf mrna in submandibular glandular cells. results among preventing, normal and model groups, egf and egf mrna expression of normal group was the highest, that of model rats was the lowest, the effect with medium dose of heshouwuyin preventing group rats was better than that of the others. in treatment groups, egf and egf mrna expressions in submandibular gland cells showed significant statistic difference compared with those in normal or model group (p<0.01). the effect with medium dose of heshouwuyin treating group rats was better than that of the others. they showed a significant difference with normal control group or selfrestoring group (p<0.01). conclusions heshouwuyin could enhance the expressions of egf and egf mrna in submandibular glands and delay aging.
【key words】 heshouwuyin; aging rat; submandibular gland; egf; egf mrna
下颌下腺是具有外分泌和内分泌双重功能的腺体，能够分泌50多种生物活性物质，其中有些已经达到激素水平，对机体器官、系统有重要的支持、营养及调节作用。wWw.11665.Com神经生长因子(ngf)、表皮生长因子(egf)是发现最早的、主要由下颌下腺产生并分泌的、对机体有重要作用的生物活性物质，其表达的改变可反映下颌下腺的功能状态。本实验采用d半乳糖诱发的亚急性衰老模型，用sp免疫组化法检测下颌下腺ngf、egf的表达，探讨何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺分泌功能的影响，为下颌下腺衰老相关疾病的防治奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物与材料
选用8周龄清洁级sd雌性大鼠90只，体重180～220 g，购自河北省实验动物中心，合格证编号：605106。何首乌饮方剂由炙何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿、丹参、茯苓组成，本院贾春华教授提供;试剂 ngf、egf、 sp试剂盒购于武汉博士德生物工程公司。
1.2 动物分组及处理
随机分为预防性和治疗性两大实验部分，每部分5组，每组9只。预防性实验部分：正常组(n)大鼠正常喂60 d。模型组(m)大鼠腹腔注射d半乳糖(300 mg·kg-1·d-1)，连续 60 d。何首乌饮预防高(ph)、中(pm)、低 (pl) 剂量组大鼠腹腔注射d半乳糖的同时分别灌胃何首乌饮(3.872，1.936，0.968 g·100 g-1·d-1，水煎浓缩成0.6 ml·100 g-1·d-1)，1次/d，连续60 d。治疗性实验部分;阴性对照组(nc)大鼠腹腔注射生理盐水(0.5 ml·100 g-1·d-1)，1次/d，连续60 d后灌胃生理盐水0.6 ml·100 g-1·d-1，1次/d，连续60 d。自然恢复组(sr)及何首乌饮治疗高(th)、中(tm)、低(tl)剂量组大鼠腹腔注射d半乳糖，造模成功后，自然恢复组正常喂养60 d。何首乌饮组分别灌胃何首乌饮(剂量同上)，1次/d，连续60 d。
1.3 免疫组织化学切片制备及染色
大鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸，经左心室插管入主动脉， 4%多聚甲醛灌注固定，取双侧下颌下腺后固定，常规脱水，透明，包埋，切片，片厚 6 μm，裱于载玻片上脱蜡、染色、去除组织蛋白等处理，操作完成后封片。在400倍显微镜下进行阳性细胞记数，计算导管细胞中阳性细胞率。
1.4 统计学方法
采用spss11.0统计软件完成，组间比较行单因素方差分析，组间多重比较用snkq检验。
2 结 果
ngf、egf阳性反应颗粒为浅棕色至深褐色，主要分布于颗粒曲管(gct)细胞及纹状管细胞顶部胞质中，腺泡细胞为阴性。提示ngf、egf可能定位于gct细胞分泌颗粒中，且同一导管内不同细胞的反应程度不同，有的细胞内颗粒清晰，着色深，有的着色浅，还有的不着色，见图1，图2。方差分析结果显示，预防性实验部分的组间ngf、egf表达比较，差异有统计学意义(p<0.01);多重比较结果显示，ngf、egf表达以n组最高，m组最低，各预防组处于中间水平，其中pm组最高。治疗性实验部分的组间ngf、egf表达比较差异亦有统计学意义(p<0.01);多重比较结果显示，ngf、egf表达以nc组最高，sr组最低，各治疗组中以tm组最高，见表1。表1 预防组、治疗组大鼠下颌下腺ngf、egf 的表达图1 各组ngf表达(sp法)图2 各组egf表达(sp法)
3 讨 论
ngf是发现最早的一类神经营养因子，它对神经系统的正常发育及功能维持，促进损伤神经的再生与修复具有重要作用〔1〕，是兼有神经营养因子与促神经突起生长因子双重作用的蛋白质〔2〕。有文献报道，ngf可促进新生动物中枢胆碱能神经元的发育成熟，并对受损伤的胆碱能神经元具有营养、修复作用〔3〕。目前，对ngf的研究已经进入临床实验阶段，研究表明，ngf可抑制神经源性肿瘤细胞的生长，还可以促进相应的神经纤维再生，有助于机体功能的恢复，另外在治疗早老性痴呆方面，可以保护中枢胆碱能神经元，防止其发生退行性病变，也可用于神经组织移植，提高植入神经元的存活率，促进它们与宿主间形成功能性联系〔4〕。我们实验表明衰老大鼠下颌下腺ngf表达明显降低，与正常组比较有高度统计学意义，用药各组较之有明显改善，可明显提高下颌下腺ngf表达，其中，预防中剂量组效果最好。
egf是60年代cohen等在纯化神经生长因子的过程中从小鼠颌下腺中提取出来的，它是一种强有力的细胞分裂因子，对细胞的生长和增殖有明显的调节作用。其最显著的生物学效应是促进上皮细胞增殖和分化，尤其对胃肠细胞具有明显的细胞保护作用 切除大鼠下颌下腺导致胃液中egf含量下降90%〔5〕。某些疾病也会影响下颌下腺分泌egf，chiou〔6〕给小鼠接种皮下肉瘤细胞后，发现其下颌下腺中gct细胞内分泌颗粒数和总面积均下降，去除肿瘤20 d后下颌下腺形态结构又恢复正常。ksasyama〔7〕证实在实验性糖尿病小鼠，下颌下腺及血浆中的egf浓度均下降。由此可见，在机体病理发生发展过程中，下颌下腺内的生物活性物质也起有一定的作用。本实验显示d半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺egf表达明显减少，药物干预各组均有不同程度的提高，何首乌饮预防组效果好于治疗组，其中，预防中剂量组效果最好。
总之，本研究显示衰老大鼠下颌下腺ngf、egf表达明显降低，用何首乌饮干预较之有明显改善，其中，预防中剂量组效果最好。提示何首乌饮可能通过增加下颌下腺ngf、egf的合成和释放而影响机体其他器官功能而达到延缓衰老的作用,具体机制有待于进一步研究。
【参考文献】
1 cohens.origins of growth factors:ngf and egf〔j〕.j biol chem，2008;283(49)：337937.
2 snider wd，johnson em.neurotrophic molecules〔j〕.annal neurol，1989;26()：489.
3 杜金凯，王春艳，葛志华.db/db糖尿病小鼠颌下腺内皮细胞生长因子和神经生长因子表达的研究〔j〕.中国老年学杂志，2008;28(14)：13901.
4 药立波.医学分子生物学〔m〕.第3版.北京：人民卫生出版社，2008：11820.
5 konturek sj.role of growth factor in gastroduodenal protection and healingofpepticulcers〔j〕.gastroentrol clin north am,1990;19 (1):416.
6 chiou cy.morphological study of granular convoluted tubules in the submandibular gland of the mouse during the growth of a sarcoma180 subcutaneous tumor〔j〕.arch histol cytol，1990;53(1):23.
7 kasayama s，ohba y，oka t.epidermal growth factor deficiency associa ted with diabetes〔j〕.proc natl acad sci usa，1989;86(10):7644.
