作者：王小英，马文丽，郑文岭
【摘要】 目的：克隆乳酸菌超氧化物歧化酶(sod)基因并进行特性分析。方法：根据已报道的乳酸菌sod基因序列,采用pcr技术获得sod碱基序列，将所得的pcr产物插入克隆载体pmd18t中,重组质粒经酶切, pcr鉴定及测序,获得的序列进行生物信息学分析。结果：成功克隆了sod基因，序列分析表明，该sod基因由621 bp组成，编码206个氨基酸残基，蛋白分子量为23 kd，等电点为4.96。结论：该蛋白氨基酸序列主要以α螺旋为主。
【关键词】 乳酸菌;超氧化物歧化酶;基因克隆
[abstract] objective: to clone and make characteristic analysis of superoxide dismutase (sod) in lactic acid bacteria. methods: based on reported genetic sequence of sod in lactic acid bacteria, obtained base sequence of sod by pcr. inserted product of pcr into cloning vector pmd18t, and made enzyme digestion of recombinant plasmid. implemented pcr identification and sequencing, and made bioinformatics analysis of sequence. results: sod gene was successfully cloned. sequence analysis indicated the gene was 621 bp, encoding 206 amino acid residues, with the protein molecular weight as 23 kd and isoelectric point as 4.96. conclusion: the main sequence of protein animo acid is alpha helix.
[key words] lactic acid; superoxide dismutase; gene cloning
超氧化物歧化酶(简称sod)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物化内超氧化物阴离子的清除剂，它能使有氧代谢产物：o2歧化为o2和h2o2,从而清除o2对生物体的毒性。wwW.11665.cOM自1969年首次被mccord和fridovich从牛血红细胞中发现和分离提取以来[1]，由于sod在抗氧化、抗肿瘤、抗衰老以及对抗细胞细胞凋亡[25]等方面起着重要作用，在医药、食品、保健品、化妆品等行业中具有广阔的应用前景。目前sod大多是从天然动植物中提取，但是，提取法由于天然原料含量极微、提取工艺复杂等原因导致制品纯度低，产量少。为解决来源的限制问题，寻找比较经济的途径是必要的。利用微生物特别是基因工程微生物制取sod的研究日益受到关注[6,7]。
乳酸菌是一类重要的工业微生物，乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，增加食品保藏期和附加值，而且具有特殊生理活性和营养功能。乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，具有降低血清胆固醇、抗肿瘤、抗衰老和免疫赋活作用[8,9]。研究证实，乳酸菌具有不同的抗氧化活性，乳酸菌的无细胞提取物具有清除机体羟自由基、过氧化氢的能力[10,11]。虽然乳酸菌的抗氧化活性已得到了证实，但它在体内的作用机制还不是很清楚，关于它的作用机制和抗氧化活性有关的物质需要进一步的研究。关于乳酸菌抗氧化性的研究越来越多地受到食品科学、预防医学等许多学科学者的广泛重视。本研究中，乳酸菌sod基因的克隆及生物信息学分析将为乳酸菌抗氧化性的进一步研究及用基因工程方法大批量生产sod奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 乳酸乳球菌购买于广东省微生物研究所菌种保藏中心;大肠杆菌dh5α由本室保存;pmd18t购买于北京天根生化科技有限公司。
1.1.2 试剂材料 细菌培养试剂购于sigma公司; la dna聚合酶、t4连接酶购自大连宝生物公司;细菌基因组提取试剂盒、dna胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、dna ladder购自北京天根生化科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 乳酸乳球菌基因组dna的提取 用灭菌双蒸水溶解干冻管里的乳酸乳球菌，并划平板到mrs固体培养基，37 ℃培养72 h，挑取单个菌落于mrs液体培养基于37 ℃摇床进行增菌。利用天根生化科技有限公司细菌基因组提取试剂盒提取乳酸乳球菌基因组dna，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。
1.2.2 引物设计与合成 所用引物根据genbank中乳酸乳球菌超氧化物歧化酶基因(sod)碱基序列(genbank序列号：geneid:1114019)设计。
p1：5'cgc ggatcc gcg atggcatttacatta3'
p2：5' ccg ctcgag cgg ttattttgctttagcat3'
上述引物由上海sangon生物工程技术服务有限公司合成 (下划线碱基分别为bamhi和xho i酶切位点)。
1.2.3 超氧化物歧化酶sod基因的pcr扩增与鉴定 反应总体积为25 μl：模板dna(1 μg/μl) 3 μl，10×buffer 2.5 μl,mg2+( 25 mm)2.0 μl, dntp(2.5 mm)2.0 μl,引物p1(10 pmol/μl) 0.5 μl,引物p2 (10 pmol/μl)0.5 μl,la dna聚合酶(5 u/ul)0.15 μl,双蒸水14.85 μl;反应条件：95 ℃，5 min;95 ℃,1 min;55 ℃,1 min;72 ℃,1 min; 30个循环;72 ℃，7 min。 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4 超氧化物歧化酶sod基因的克隆与鉴定 pcr扩增出目的基因，1%琼脂糖电泳，切胶后用dna胶回收试剂盒进行回收，得到的pcr纯化产物与pmd18t进行连接，转入新制备的感受态大肠杆菌dh5α，再涂布于含氨苄青霉素的lb培养基上37 ℃培养过夜，用接种针分别挑取其中的5个菌落于含氨苄青霉素的lb液体培养基上增菌培养。采用小量质粒提取试剂盒分别对4管菌液提取质粒。采用双酶切(bamh i和xhoi)和pcr的方法分别对重组子1、2、3进行鉴定。经鉴定的阳性重组质粒送北京天根生化科技有限公司测序。
1.2.5 超氧化物歧化酶sod基因序列的生物信息学分析 利用生物软件protparam对所克隆的蛋白质进行物理和化学变量分析。利用在线分析软件sopma、hnn对其进行二级结构进行分析。并利用在线分析软件blast在ncbi数据库中进行同源性搜索，选取与乳酸菌sod同源性较高的链球菌科12种sod氨基酸序列，用clusalx1.8 程序进行多序列比对，并用mega4构建系统进化树。
2 结果
2.1 超氧化物歧化酶基因克隆与鉴定
用细菌基因组提取试剂盒提取乳酸乳球菌基因组dna，1%琼脂糖凝胶电泳，可见到清晰的条带。以该基因组dna为模板，进行目的基因的pcr扩增，结果可扩出621 bp的目的片段(图1)。
注：m：100 bp dna marker; 1、2：soda 的pcr 产物。
图1 soda基因的pcr扩增注：m： marker iv; 1、2、3、4:t+sod质粒。
图2 pmd18tsoda质粒 将该目的基因片段进行胶回收纯化后，与pmd18t进行连接，转化感受态大肠杆菌dh5α，通过氨苄青霉素筛选，得到5个菌落分别对4个菌落进行小量质粒提取，用1%琼脂糖凝胶电泳所提质粒(图2)，可见到清晰的质粒电泳条带。分别以1、2、3号质粒进行pcr及bamh i/xhoi双酶切(图3)鉴定(图4)，1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果与预期片段大小相符，初步证明包含超氧化物歧化酶基因的重组质粒pmd18tsoda构建成功。
2.2 测序结果及生物信息学分析
序列测定证明,构建的重组载体中含有超氧化物歧化酶全长编码序列。利用在线分析软件protparam对已克隆基因进行分析，推测出该基因编码的蛋白质是由206个氨基酸组成，分子量为23 kd，等电点为4.96。利用在线分析软件hnn、sopma对其蛋白序列进行2级结构分析，结果发现该蛋白氨基酸序列中，α螺旋占的比例很大，占氨基酸总数的51.94%共有107个氨基酸组成α螺旋;10个氨基酸组成β转角;59个氨基酸组成无规卷曲;30个氨基酸组成扩展链(图5)。
3 讨论
本实验成功克隆了乳酸菌sod基因并进行了生物信息学分析，推测出该基因编码的蛋白质是由206个氨基酸组成，分子量为23 kd，等电点为4.96。2级结构分析表明，该蛋白氨基酸序列主要以α螺旋为主。所克隆的sod基因氨基酸序列与其他12种细菌已知的该酶氨基酸序列进行多序列比对，结果显示：各种物种sod氨基酸序列具有较高的保守性，特别是与金属结合结构域的氨基酸在这些不同的物种中是完全相同的，这与其他文献中sod高度保守的金属结合结构域是一致的，这种保守性说明sod在细菌中具有重要的功能。
sod的主要作用是清除细胞内过量的氧自由基, 避免当机体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应,在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能,受到国内外学者和研究者的广泛关注。到目前为止，对sod的生理功能以及各种来源(包括动物、植物、微生物等)的sod等进行了广泛研究。但对于乳酸菌sod基因的研究报道却很少。本实验中超氧化物歧化酶基因的成功克隆及生物信息学分析对了解乳酸菌的分子生物学机制,为进一步研究乳酸菌超氧化物歧化酶基因抗氧化活性机制、酶学特性，及基因工程生产该酶提供了基础数据。
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