【摘要】 【目的】探讨六味地黄丸含药血清对单纯疱疹病毒核苷激酶/丙氧鸟苷(hsvtk/gcv)系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤b16细胞株的增效作用,为提高临床基因治疗肿瘤疗效提供新思路。【方法】构建并鉴定恶性黑色素瘤b16细胞hsvtk/gcv治疗系统,制备六味地黄丸含药血清及对照血清,将b16、b16/tk细胞按20%(1∶4)的比例混合制成细胞悬浮液接种于96孔培养板上,分为对照血清组、含药血清组、对照血清联合gcv组、含药血清联合gcv组,其中含药血清组及含药血清联合gcv组按血清体积分数计又分高(10%)、中(5%)、低(25%)3组,gcv的终浓度为25 μmol/l,按分组添加相应的含药血清,每孔培养液总体积200 μl,37℃、体积分数5%的co2培养箱培养。48 h后采用四甲基偶氮唑盐(mtt)法检测杀伤效应。采用金正钧q值法分析六味地黄丸含药血清与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。【结果】mtt实验表明联合用药组对b16细胞的抑制率明显高于其他组,六味地黄丸含药血清对b16细胞株hsvtk/gcv系统的增效作用存在量效关系：25%、5%、10%含药血清联合20%tk/gcv组的实际抑制率(4875%、5939%、6928%)显著高于理论抑制率(3813%、3867%、3992%),金正钧q值分别为128、154、174,均大于115,具有协同增效作用。【结论】六味地黄丸含药血清对b16细胞株hsvtk/gcv系统旁观者效应有明显的增效作用,且具有一定的量效关系。WwW.11665.com
【关键词】 六味地黄丸/药理学;自杀基因疗法;黑色素细胞/病理学;细胞培养
恶性黑色素瘤被选择作为肿瘤基因治疗的第一个临床试用目标,经过近20年的摸索已取得了长足的进展,其中自杀基因疗法以其独特的旁观者效应而备受青睐[1]。目前单纯疱疹病毒ⅰ型核苷激酶(hsv1tk)自杀基因治疗转移性恶性黑色素瘤已应用于ⅰ/ⅱ期的临床研究[2],但仍存在转染效率低、靶向性不够、治疗载体的毒副作用等问题,使单纯自杀基因治疗难以完全治愈恶性黑色素瘤。联合治疗是提高自杀基因治疗疗效的方法之一。前期实验表明[3]滋阴补肾经典名方六味地黄丸对小鼠移植性恶性黑色素瘤自杀基因治疗具有增效作用,本研究拟通过体外实验进一步论证,在构建黑色素瘤b16细胞hsv1tk自杀基因治疗系统的基础上观察六味地黄丸对其旁观者效应是否具有增效作用,现将结果报道如下。
1材料与方法
11实验动物及细胞sd大鼠,体质量200～220 g,雄性,健康,spf级,广州中医药大学实验动物中心提供, 合格证号：scxk(粤)20030001,粤监证字：2007a024;小鼠恶性黑色素瘤细胞株b16购于中山大学动物中心细胞库。
12试剂及耗材细胞培养用rpmi1640粉和25 g/l含乙二胺四乙酸(edta)胰酶为gibco公司产品,新生牛血清为奥地利 paa公司产品,青、链霉素合剂为杭州吉诺生物医药技术有限公司产品,四甲基偶氮唑盐(mtt)、二甲基亚砜(dmso)、丙氧鸟苷(gcv)均为美国sigma公司产品,细胞培养用培养板、培养瓶、培养皿、冻存管均为德国greiner bioone公司产品,一次性微孔滤膜为美国corning公司产品,2倍tap pcr master mix为天根生化科技(北京)有限公司产品,基因组dna提取试剂盒为上海申能博彩生物科技有限公司产品,琼脂糖粉为美国amresco公司产品,dna凝胶电泳指示染料gold view购自北京赛百盛生物工程技术有限服务公司。
13主要仪器bna3210型co2培养箱(日本espec公司),jh型超净工作台(苏州净化设备厂),xds1b型倒置显微镜(重庆coic公司),680型酶标仪(美国biorad公司),xyj801型电动离心机(江苏省金坛市医疗仪器厂),318k型高速冷冻离心机(德国sigma公司),jb1型磁力搅拌器(上海雷磁仪器厂新泾分厂),tp600型pcr仪(大连takara公司),dyy8c型稳流稳压电泳系统(美国biorad公司),gen doc 1000型凝胶成像系统(美国biorad公司),ix71f22fl/ph型图像采集系统(日本olympus公司),80210398型紫外分光光度计(英国pharmcia biotech公司)。
14恶性黑色素瘤细胞hsvtk/gcv治疗系统的构建与鉴定
141恶性黑色素瘤细胞hsvtk/gcv治疗系统的构建取pt67/tk细胞病毒上清液感染对数生长期的b16细胞,g418抗性筛选阳性克隆命名为b16/tk并扩大培养。
142恶性黑色素瘤细胞hsvtk/gcv治疗系统的鉴定提取b16/tk细胞基因组dna,采用pcr法对tk基因进行鉴定。引物由invitrogen公司广州合成部合成,上游引物：5gcagcaagaagccacggaagtc3,下游引物：5gtgttgtgtggtgtagatgttc3,产物片段：226 bp。 pcr反应体系：模板dna 05 μg、上下游引物(10 μmol/l)各025 μl、2倍tap pcr master mix 5 μl,用ddh2o补足体积至10 μl。pcr循环条件：94℃预变性5 min,94℃变性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环,最后72℃延伸7 min。扩增结束后,用20 g/l琼脂糖凝胶进行电泳。
143b16/tk生物活性检测方法将b16/tk和野生型b16细胞分别以2×103、3×103、5×103个/孔细胞接种96孔板,同时加入不同浓度的gcv使终浓度分别为001、01、1、10、100、500 μmol/l,以不加gcv的细胞孔作对照,每一浓度设3个复孔,倒置显微镜观察杀伤效应并摄像。
15gcv工作浓度及tk+比例确定方法将b16/tk和b16按照0%、10%、20%、40%、100%比例混合,分别加入gcv，终浓度为0、625、125、25、50、100、200 μmol/l,mtt法检测杀伤效率。
16对照血清与含药血清的制备及其对b16细胞生长影响的检测方法
161血清制备spf级健康sd大鼠30只,随机分为六味地黄丸组与对照组,分别灌服六味地黄丸研磨液8 ml(含生药4 g)和等容积的蒸馏水,连续灌胃4 d,末次给药后1 h腹主动脉取血,制备血清,-70℃冰箱保存备用。
162分组及检测方法体外实验设5组(以体积分数计，下同),即10%新生牛血清组，10%对照血清组，25%含药血清组(75%对照血清和25%含药血清)，5%含药血清组(5%对照血清和5%含药血清)，10%含药血清组,采用mtt法检测不同浓度血清对b16细胞生长的影响,酶标仪在570 nm波长处测定每孔的光密度(d)值并计算细胞抑制率：p细胞抑制(%)=(1-d测定孔/d对照孔)×100%。
17对照血清与含药血清对b16细胞株tk/gcv系统增效作用量效关系的检测方法按b16/tk占总细胞数的20%(1∶4)比例混合b16与b16/tk细胞,设置10%对照血清组，25%、5%、10%含药血清组，10%对照血清联合gcv组,25%、5%、10%含药血清联合gcv组。采用mtt法检测各组细胞的抑制率,并采用金正钧q值法[4]分析六味地黄丸含药血清与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。
18统计学方法采用spss 130 统计软件处理,各组间实验数据比较采用两样本均数的t检验,多组间比较用oneway anova法。
2结果
21恶性黑色素瘤细胞hsvtk/gcv治疗系统的构建与鉴定结果
211琼脂糖凝胶电泳结果以pt67/tk细胞病毒上清液感染的b16细胞,经过抗性筛选后,pcr鉴定结果见图1,野生型b16细胞组未见条带,b16/tk组可见一清晰条带,产物位于200～300 bp之间。
212b16/tk生物活性测定结果倒置显微镜观察野生型b16和b16/tk在添加gcv前生长状态与数目无明显差异,加gcv后48 h观察,b16/tk的高浓度组(10、100、500 μmol/l)大部分细胞出现死亡,表现为胞膜不完整、轮廓模糊、不透亮、形状不规则、并且碎裂成小粒状,且密度为2×103/孔时最明显,1 μmol/l组仅见极少数细胞死亡,且细胞发生明显增殖,其他浓度组及野生型b16细胞组均呈现明显的细胞增殖。密度为2×103/孔的b16和b16/tk在添加10 μmol/l gcv 48 h后的细胞形态见图2(彩图见第556页)。
22gcv工作浓度及tk+比例的确定结果图3、图4(彩图见第557页)结果显示,当gcv浓度达625 μmol/l以上时对b16/tk细胞表现出一定的杀伤效应,gcv浓度达100 μmol/l以上时对b16有一定的细胞毒性作用,选择对b16/tk敏感而对b16无细胞毒性的gcv浓度(625~100 μmol/l),并且发挥最大杀伤效应的最低gcv浓度作为本实验的最适gcv工作浓度,故gcv 的工作浓度确定为25 μmol/l。
40%b16/tk与100%b16/tk组在较低浓度的gcv(625 μmol/l)时,就能杀伤几乎全部细胞(b16/tk与b16),即40%b16/tk细胞混合时比例太高,杀伤效应太强,联合杀伤没有发挥的空间;而b16与10%b16/tk组在gcv浓度很高(100 μmol/l)时,杀伤效应也很弱;20%b16/tk组则既能观察到旁观者效应,又为中药留有足够的发挥空间,故后续实验选用20%b16/tk比例混合组。
23对照血清与含药血清对b16细胞生长的影响含药血清孵育前,倒置显微镜下观察各组细胞生长状态良好,细胞形态与数目无明显差异,添加相应血清后48 h镜下观察细胞贴壁稳定,细胞密度高,生长旺盛,含药血清组细胞数目多于10%新生牛血清组与10%对照血清组。mtt法检测结果见表1,10%对照血清组与10%新生牛血清组对细胞作用比较差异无显著性意义(p>005),而六味地黄丸含药血清各组对细胞有增殖作用(均p<001)。
24各组对b16细胞株hsvtk/gcv系统增效作用量效关系的检测结果mtt法分析各组的抑制率见表2,含药血清联合gcv各浓度组的实际抑制率明显高于相应浓度的理论抑制率,金正钧q值分别为128、154、174,均大于115,具有协同增效作用。表1各组对b16细胞生长的影响(mtt检测)表2各组对b16细胞株hsvtk/gcv系统
3讨论
黑色素瘤是表皮基底黑色素细胞发生的恶性肿瘤,好发于头颈部,其恶性程度高,容易复发和转移,预后差。临床治疗以手术切除为主,放疗化疗效果差[5],基因治疗尤其是自杀基因疗法给黑色素瘤患者带来了希望。自杀基因疗法即将自杀基因导入肿瘤细胞中,其基因表达产物可选择性地将低毒或无毒的前体药物代谢成有毒代谢产物,这些有毒代谢产物通过干扰细胞dna正常合成而使细胞死亡[6]。自杀基因疗法有一个突出的优点“旁观者效应”(bystander effect),即导入自杀基因的肿瘤细胞对邻近的未导入自杀基因的肿瘤细胞具有杀伤作用,近年来备受关注[7]。bonnekoh等[8]在黑色素瘤自杀基因治疗的模型研究中发现,肿瘤体积减少的程度(80%)与转导效率推测的程度不成比例,考虑到可能是通过旁观者效应杀伤未导入基因的邻近分裂细胞,提高旁观者效应。
hsv1tk/gcv系统是最常用的自杀基因治疗系统,旁观者效应的有无关系到hsv1tk/gcv系统治疗的成败,除极少数细胞株未发现旁观者效应外,绝大多数细胞株均有旁观者效应。不同细胞对该系统敏感性的差异,很大程度上与旁观者效应的强弱有直接关系。如图4(彩图见第557页)示低浓度(625 μmol/l)的gcv能杀伤70%以上的100%b16/tk细胞,提示b16/tk具有生物活性,b16细胞株对gcv敏感。但是转染效率低下却是临床上应用基因治疗面临的主要难题,在tk转染低效率的情况下能获得较强的旁观者效应将为自杀基因的应用带来更广阔的前景。
为了更好地观察六味地黄丸对旁观者效应的增效作用,我们将b16/tk与b16细胞以不同比例混合后检测其对gcv的敏感性,发现b16/tk所占比例在40%及以上时低浓度的gcv(625 μmol/l)即可发挥极强的旁观者效应,联合杀伤时中药没有发挥药效的空间;而b16/tk所占比例在10%时高浓度gcv(200 μmol/l)也未能显示出明显的杀伤效应,可能是10%b16/tk组tk+比例太低,旁观者效应太弱,另外考虑到b16/tk系统构建时g418筛选后得到的tk+克隆并非单细胞克隆,即实际混合的10%b16/tk可能并未达到10%tk+,也可能是其未能观察到旁观者效应的原因之一;20%b16/tk在gcv浓度为25 μmol/l时对细胞生长的抑制率为349%,能观察到一定的旁观者效应,并且还有足够的杀伤空间,故此六味地黄丸和自杀基因联合杀伤药效学实验选用20%b16/tk的混合细胞。
本研究中采用的中药血清药理学方法不仅能反映中药及其代谢产物的药理作用,而且能反映可能由药物诱导机体内源性成分所产生的作用,更接近药物在体内环境产生的真实过程,对中药复方的药理学研究具有明显优势。前期研究表明：大鼠血清本身对恶性黑色素瘤b16细胞有一定促生长作用,血清浓度在10%以内时细胞生长状态较好,随血清浓度的增高细胞状态变差。借鉴此结果,本实验选择体积分数25%、5%、10%的含药血清作为工作浓度。无论是细胞培养用牛血清还是含药血清,其成分复杂,为了减少实验中的影响因素,本研究在前期工作的基础上加以改进。在细胞无血清培养的基础上添加含药血清,用对照血清作为对照组,含药血清采用10%总体积,为了排除大鼠血清本身对细胞的影响,药物血清不足10%者,用大鼠对照血清补足体积。
本实验结果显示：与单独自杀基因组(加对照血清)或单独含药血清组比较,联合用药明显提高了对恶性黑色素瘤细胞的旁观者效应,差异均有显著性意义(p<001),协同性分析显示联合用药组对恶性黑色素瘤细胞的杀伤作用是一种协同效应(q>115),这种协同效应可能源于旁观者效应。旁观者效应的可能机制有缝隙连接机制、免疫介导机制、细胞凋亡机制、介质机制等。体外实验无免疫介导机制,可见六味地黄丸可能通过缝隙连接机制或细胞凋亡机制介导旁观者效应,达到协同增效作用,具体如何调节细胞缝隙连接通讯或细胞周期与凋亡从而增强旁观者效应还有待于进一步深入研究。
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