【摘要】 目的: 探讨dcsignr在人胎盘绒毛组织中的定位及在体外培养滋养层细胞上的表达。方法: 建立稳定的滋养层细胞原代培养体系, 采用免疫组化单染及荧光双染的方法检测不同孕期正常胎盘绒毛组织及体外培养滋养层细胞上dcsignr的表达。结果: dcsignr主要表达于胎盘滋养层细胞、 hofbauer细胞及胎盘微血管内皮细胞的胞质及包膜, 在原代培养的人绒毛膜滋养层细胞中的dcsignr的表达与在体组织表达一致。结论: dcsignr表达于不同孕期的胎盘组织及体外分离培养滋养层细胞, 为研究滋养层细胞上该受体在宫内感染中的作用提供体外实验的细胞学基础。
【关键词】 滋养层细胞 dc singr 免疫组织化学 宫内感染
expersstion of dcsignr in the primary trophoblast cells and its significanc
zhang qin, li junnan, linag zhiqing
department of obesterics and gynecology, southwest hospital, third military medical university, chongqin 400038, china
[abstract] aim: to study the expression of dcsignr in human placenta and trophoblast cells cultured in vitro, and provided a basis for experiment in vitro aiming to investigate the mechanism of receptormediated intrauterine transmission. methods: primary culture system of human chorionic trophoblast cells were established. the expression of dcsign and dcsignr was determined by immunohistochemistry(ihc) stain. results: dcsignr was mainly expressed in the membrane and plasm in placental trophoblast cells, hofbauer cells and placental vascular endothelial cells. conclusion: the expression of dcsignr in human placenta and trophoblast cells cultured in vitro is determined by ihc; the study provides a cellular basis for experiment in vitro aiming to investigate the mechanism of receptormediated intrauterine transmission.
[keywords]trophoblast cells; dcsignr; ihc; intrauterine infection
病毒如何突破胎盘屏障的第一道防线滋养层细胞？其具体传播途径尚不明确。www.11665.Com研究发现, 病毒可通过受体介导途径侵入细胞[1]。滋养层细胞表面存在有此作用的受体。从人胎盘库中筛选出一种未知的钙离子依赖c型凝集素, 后来证实就是dcsign[2], 它因参与hiv的感染并介导免疫启动而成为凝集素家族的研究焦点。其相关同源物dcsignr与dcsign在氨基酸水平有77%的同源性, 也具有吸附和传递hiv的作用。如今, dcsignr在病理, 尤其在感染形成中的作用已受到相关领域的广泛关注。
我们建立了稳定的滋养层细胞原代培养体系, 并运用免疫组化、 免疫荧光等方法观察不同孕期的胎盘、 体外分离培养滋养层细胞上dcsignr的分布, 为进一步研究滋养层细胞上这该受体在宫内感染中的作用提供体外实验的细胞学基础。
1 材料和方法
1.1 材料 羊抗人dcsignr多克隆抗体(sc17261)浓缩液购自美国santa cruz公司; fitc标记山羊抗小鼠荧光抗体、 tritc标记兔抗山羊荧光抗体和免疫组化sp9003试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。流产孕妇来源于重庆西南医院妇产科门诊, 孕8～12周, 胚胎发育正常且为自愿, 人工流产术中所取绒毛置于预冷的生理盐水中迅速带回实验室, 立即行细胞培养。来自西南医院妇产科取不同孕期正常的胎盘绒毛组织(大小约1 cm3), 立即用组织体积20倍的40 g/l多聚甲醛液固定, 石蜡包埋(温度低于60℃)、 连续切片(厚度6～7 μm), 用于免疫组化检测。
1.2 方法
1.2.1 滋养层细胞的分离及鉴定 采用胰蛋白酶/dnase序贯消化法行人绒毛膜滋养层细胞的分离; 用35%～45%的不连续percoll密度梯度离心方法纯化细胞; 抗细胞角蛋白7（ck7）抗体对分离纯化细胞进行鉴定[3]。
1.2.2 免疫组化单染、 荧光双染检测dcsignr (1)不同孕期胎盘绒毛组织dcsignr染色: 石蜡切片烤片(58～60)℃ 1 h; 经二甲苯、 梯度酒精脱蜡至水; 30 ml/l过氧化氢37℃处理切片20 min, 封闭内源性过氧化物酶; 蒸馏水冲洗, 0.01 mol/l pbs(ph7.2～7.4)漂洗3次, 每次5 min; 按照一抗要求对组织行预处理; 0.01 mol/l pbs(ph7.2～7.4)漂洗3次, 每次5 min; 正常山羊血清37℃孵育15 min, 倾去, 不洗; 滴加一抗(抗dcsignr抗体1∶400稀释), 湿盒内孵育, 4℃过夜; 0.01 mol/l pbs(ph7.2～7.4)漂洗3次, 每次5 min; 生物素化二抗37℃孵育15 min; 0.01 mol/l pbs(ph7.2～7.4)漂洗3次, 每次5 min; 辣根酶标记链霉卵白素37℃孵育15 min; 0.01 mol/l pbs(ph7.2～7.4)漂洗3次, 每次5 min; dab显色。新鲜配制显色液室温下显色, 显微镜下观察至染色深浅合适时自来水洗涤终止显色苏木素复染1 min, 自来水冲洗, 镜下观察, 颜色较深可用稀盐酸酒精分色1～2 s, 自来水冲洗; 系列酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片, 镜检并照相记录。对照实验用pbs代替一抗作为空白对照。(2)免疫组化单染结果显示ck7(鼠抗人)、 dcsignr(羊抗人)的定位相同(均在胞质), 且两种一抗的种属来源不同, 适用于免疫荧光双重染色。主要步骤如下: 切片脱蜡水化; pbs冲洗3次, 每次5 min; 滴加一抗混合液(鼠抗人ck7抗体1∶50稀释＋羊抗人dcsignr抗体1∶100稀释), 4℃湿盒过夜; pbs冲洗3次, 每次5 min; 滴加荧光二抗混合液(fitc标记山羊抗小鼠荧光抗体1∶50+tritc标记兔抗山羊荧光抗体1∶50), 湿盒避光, 37℃孵育45 min; pbs冲洗3次(避光), 每次5 min; 封片, 激光扫描共聚焦显微镜下观察、 拍照。对照实验用pbs代替一抗作为空白对照。
2 结果
2.1 滋养层细胞的生长形态学观察及鉴定 分离纯化后的细胞以单个核细胞为主, 贴壁细胞多呈上皮细胞样生长, 大小不一, 形态多样, 呈不规则多角形或卵圆形, 排列密集时可呈铺路石征。细胞界线清楚, 胞质透明, 核大呈椭圆形。免疫组化学染色dab显色后的阳性信号为棕黄色颗粒。绒毛组织上滋养层细胞的ck7染色阳性, 着色于胞质(图1), 原代培养细胞的ck7阳性率近90%(图2)。
2.2 dcsignr在胎盘组织及培养细胞中的蛋白表达 (1)dcsignr在不同孕期的胎盘组织中均有表达, 棕黄色阳性着色主要位于滋养层细胞的胞质及膜, hofbauer细胞的胞膜, 微血管内皮细胞的胞质及膜(图3)。pbs空白对照为阴性。（2）早孕绒毛组织滋养细胞层可见绿色荧光(代表ck7阳性), 主要位于细胞滋养层细胞胞质, 合体滋养层细胞上表达较弱。同时可见红色荧光(代表dcsignr阳性), 表达于滋养层细胞和hofbauer细胞的胞质。采用免疫荧光双标记技术检测这两种抗原, 除红绿色荧光外, 黄色荧光是ck7、 dcsignr的重叠色, 细胞胞质表达黄色荧光说明该细胞为滋养层细胞, 并确实表达dcsignr(图4)。体外培养滋养层细胞与组织荧光染色结果一致。pbs空白对照亦为阴性。
图1 早孕绒毛组织ck7的免疫组化染色（×200）（略）
图2 原代培养滋养层细胞ck7免疫组化染色（×200）（略）
图3 胎盘组织dcsignr免疫组织化染色（×200）（略）
图4 早孕绒毛组织ck7、 dcsignr荧光双染（略）
3 讨论
本研究借鉴并改良传统酶消化法, 根据胰酶作用特点迅速而表浅, dna酶能减少胶冻样物质形成的特点, 在胰酶消化相对充分后加入dna酶继续消化, 从而使消化更完全。此法缩短了胰酶作用时间且节约了酶量, 大大提高了细胞活力。因酶的作用顺序类似临床中调节人工周期的序贯法, 故称此法为胰酶/dna酶序贯消化法。本实验除参考kliman等[4]的报道, 也借鉴了国内程勇前等[5]35%～45%的不连续percoll密度梯度离心方法纯化细胞, 并根据成纤维细胞比上皮细胞贴壁过程快, 滋养层细胞在短时间内附着不稳定, 且在无血清支持下贴壁更慢的特点, 我们采用无血清培养基混悬细胞沉淀、 换孔等方法进一步纯化细胞。细胞鉴定是培养细胞的重要环节。blaschitz等[6]报道, 不同类型细胞角蛋白并不具备滋养层细胞特异性, 它们既与滋养层细胞反应, 又与绒毛间质细胞结合, 仅ck7抗体对滋养层细胞特异性最强。本实验用ck7抗体对分离纯化细胞进行染色, 阳性率近90%, 证明原代培养的细胞为滋养层细胞, 其纯度符合后续实验要求。
dcsignr能识别hiv、 hcv、 cmv, 并介导其顺式或反式感染[7]。这些病原体有潜伏期长, 能长时间滞留体内而导致慢性感染等共同特性, 可见dcsign在病原体的慢性感染和免疫逃避中发挥重要作用。dcsignr能与icam3结合, 即可发生t细胞和内皮细胞表面的相互作用, 增加病毒感染的可能性[8]。目前已发现与dcsignr结合的还包括多种病毒、 细菌、 寄生虫和真菌。dcsignr在体内有较广泛的组织分布和细胞表达。dcsignr的分布为研究其功能提供线索。dcsignr主要表达于淋巴窦内皮细胞、 肝窦内皮细胞和胎盘微血管内皮细胞等。进而, 我们推想dcsignr在病毒的宫内传播中可能起重要作用。细胞表面该受体的存在是受体介导作用的基础条件, 也是我们关注的问题。
本研究中采用免疫组织化学法对早、 中、 晚3个不同孕期的胎盘绒毛组织切片进行染色, 明确了dcsignr在胎盘中的分布: dcsignr表达于hofbauer细胞的胞膜、 微血管内皮细胞的胞质及膜。这些染色结果与现有的文献报道基本相符。值得注意的是在实验中我们检测了dcsignr在滋养层细胞中的表达: 其染色则主要位于胞质。运用免疫组化双染法和激光共聚焦(dcsignr与ck7的荧光双染结果显示: ck7的绿色荧光主要表达于滋养层内层的细胞滋养层细胞。ck7在早孕组织主要表达于滋养层的基底膜。随着妊娠的发展, 其在合体滋养层细胞顶膜的表达将增多。证明体外培养细胞为滋养层细胞并确实表达dcsignr。体外培养细胞与胎盘组织染在色结果一致, 说明体外培养的滋养层细胞并未丢失这种受体, 可为后续体外实验提供细胞学基础。结合dcignr介导病毒内吞的特性和其在滋养层细胞上的表达, 我们推测, 病毒有可能通过dcignr受体介导的方式穿透胎盘屏障最外层滋养层细胞, 进而逐层感染各层细胞导致胎儿感染滋养层细胞中的dcsignr是否具有吸附和传递病毒的作用？它们结合的病毒是否在滋养层细胞中复制？有待进一步地研究。
dcsignr较高水平的表达为其结合、 传递病毒提供条件, 并且其转录存在个体差异。因此, 其表达的定量分析更具意义。因研究时间受限, 本实验还有待完善。运用rtpcr、 western blot分别从分子水平和蛋白水平进一步证实dcsignr在滋养层细胞上的表达; 可进行不同孕期滋养层细胞的原代培养, 检测受体在滋养层细胞上的表达并作定量分析, 了解dcsignr的表达随着妊娠的发展是否会有量的变化。
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