【关键词】 动物 遗体修饰 小鼠 转基因 显微注射 基因转移技术
目前常用的转基因动物制备方法有显微注射法、逆转录病毒感染法、精子载体法、胚胎干细胞介导法、人工酵母染色体法及电转移法等[16]。其中显微注射仍是最可靠、最广泛使用的一种方法,因其外源基因整合效率高,对目的基因无大小限制,且可以直接获得纯系[78]，但其过程烦琐且要求严格,将基因液装入微注射针是其成功的关键前提[910]。当前各实验室普遍使用可编程微量注射仪,该仪器要求将基因液面倒吸至注射针的直管部以获得稳定平衡压力,但仅用其吸入功能无法达到,导致培养液倒吸,基因液被稀释,从而大大影响了转基因成功率。笔者建立一种简单有效的方法以克服这一缺点。
1 材料与方法
1.1 仪器和材料 pn30拉针仪,mf900煅针仪,im300可编程微量注射仪（日本narishige公司）；倒置显微镜,显微操作仪（日本olympus公司）,g100薄壁毛细玻璃管（1×90 mm,日本narishige公司）或bj40薄壁毛细玻璃管（1.0×100 mm,北京正天易科贸有限责任公司）,玻璃管（2.5×200 mm,北京正天易科贸有限责任公司）,一次性培养平皿（美国bd falcon公司）,显微注射用基因液,m2培养液,石蜡油（m8410,美国sigma公司）。
1.2 仪器参数
1.2.1 注射针 拉针仪：主磁61，副磁23；温度70 ℃；煅针仪：弯针温度20～25 ℃。Www.11665.cOm
1.2.2 可编程微量注射仪 input：60～100 psi（1 psi=6.895 kpa）；clr：60～70 psi,0.1 s；baln：0.8 psi；fill：60 psi,60 s；inj：0.5～0.8 psi,0.02 s。
1.3 方法
1.3.1 注射针制备 设定对应的拉针仪参数,装上毛细玻璃管,用固定旋钮固定好,按下拉针仪开关,将其拉制成开口小于1 μm的注射针；取下注射针装在煅针仪的持针架上,将注射针移至玻璃球侧面,使其内径20 μm处靠近玻璃球,设定好煅针仪的温度参数,点压加热开关,将其弯成25°。
1.3.2 微载管制备 用两把镊子夹住直径为2.5 mm的玻璃管两端,将其中部置于酒精灯火焰上灼烧,待其软化后,快速向外拉伸。在距肩部约9～10 cm处用砂轮裁断细部,将细部的尖端在锻针仪上锻烧,使开口边缘变光滑。这样制备的微载管外直径约200～400 μm,用于将石蜡油装入显微注射针。
1.3.3 基因液的装载及比较 将相同参数下制备的注射针分成2组,每组3根,分别按照下面2种方法将基因液装入针内。
1.3.3.1 针尖倒吸法（a法） 将注射针装到显微操作仪持针器上,并与可编程微量注射仪相连接,调好可编程微量注射仪各部分参数,打开“baln”功能；在培养皿盖子上作一个3 μl基因液液滴,覆盖上石蜡油,将其置于倒置显微镜的载物台上,调整注射针角度,使其进入基因液滴,按下注射仪的“fill”按键,将基因液倒吸进入注射针,按下注射仪的“fill”按键数次,观察注射针内液面的变化。
1.3.3.2 改良法（b法） 用微载管吸取少量（约5～10 μl）灭菌石蜡油并从显微注射针的背部注入,直到液面到达注射针的直管部（图1）,小心取出微载管,通过橡胶管将注射针背部与注射器相连,按压注射器活塞对石蜡油轻轻施压,使得针内液面向针口缓慢移动,最终充满整个注射针尖部；后续操作同1.3.3.1。
图1 显微注射针各部分示意图（略）
fig 1 representation of each part of microinjection pipette
1.3.4 显微注射模拟及比较
1.3.4.1 平衡压力的观察 保持显微注射仪所有参数不变,将m2培养液装填于3.5 mm培养皿盖并置于倒置显微镜的载物台上,调整注射针角度,驱动显微操作臂使其缓缓下降进入m2培养液中,在倒置显微镜20×物镜下调节焦距至基因液液面清晰,观察注射针内基因液液面的位置变化,以判断此时显微注射仪提供的平衡压力是否能够抵消培养液的虹吸效应,产生使基因液缓慢外流的正压。
1.3.4.2 模拟注射后液面变化 保持显微注射仪所有参数不变,调好注射仪的“inj”功能,反复按压“inj”按键模拟显微注射过程＞30次后,按压“clr”按键10次,在倒置显微镜20×物镜下观察注射针内液面变化情况。
1.3.4.3 液面变化数值统计学处理 调节焦距至基因液液面清晰,记录此时基因液液面在目镜测微尺上的刻度（起始位置）,10 min后再次观察并记录液面在目镜测微尺上的刻度（终止位置）。将2组注射针内基因液液面在10 min的位置变化差值进行统计分析,并作配对资料t检验,采用microcal origin 3.0软件中的t检验(two population/pared),检验水准取α＝0.05。
2 结果
2.1 基因液的装载及比较 用a法装载基因液后,按压“fill”按键,基因液倒吸入注射针内,当液面上升到注射针尖细部一定位置后,再按压“fill”按键多次,注射针内液面没有明显变化。而b法的注射针内石蜡油与基因液界面仍然可以上升,甚至到达注射针直管部。
2.2 显微注射模拟及比较
2.2.1 平衡压力的观察 分别使用2种方法装载基因液后,将注射针缓缓下降进入m2培养液中,在倒置显微镜20×物镜下都观察到注射针内基因液液面缓慢向针尖方向移动。
2.2.2 模拟注射后液面变化 反复按压“inj”按键模拟显微注射过程＞30次后,按压“clr”按键10次,在倒置显微镜20×物镜下观察,用a法装载的基因液液面缓慢上升,m2培养液倒吸进入注射针；用b法装载的基因液界面仍然缓慢下降。
2.2.3 液面变化数值统计学处理 a组注射针内基因液液面在10 min的位置变化为12.5、3.5、6.0，x±s为7.33±4.65；b组为-6.5、-6.0、-8.5，x±s为-7.00±1.32（差值为正表示针内液面向针尖方向移动,差值为负表示液面向针背方向移动）。两组数据比较具有统计学意义（p<0.05）。
3 讨论
原核显微注射法制备转基因小鼠是一个严格而烦琐的过程,其中将基因液装入注射针是显微注射之前必不可少的关键一步。目前完成该步骤的方法有3种：针背虹吸法、针背填充法以及针尖倒吸法。前2种方法均需要特殊的毛细管,且操作过程中极容易污染基因液,每次操作基因液的用量大,成本较高。而针尖倒吸法是利用可编程微量注射仪的“fill”功能将基因液直接从注射针针口倒吸进入注射针。该法将基因液从针口倒吸进入注射针,既不需要使用昂贵的微载管,且每次只须<1 μl的基因液,可以很大程度地节约基因液的用量；另外,每次吸取少量基因液做成基因液滴的方法可以很大程度地保持基因液的纯度,在操作过程中也不会对基因液造成污染。因此,使用倒吸法装载基因液是最经济、简便的一种方法。
3.1 a法的缺陷 笔者使用a法进行转基因动物实验的过程中发现,按压“fill”按键,当液面上升到注射针尖细部一定位置后,再按压“fill”按键多次,注射针内液面没有明显变化,表明a法不能通过人为控制吸入足够量的基因液。装好基因液的注射针下降进入培养液后,在显微镜下可以观察到针内液面缓慢下降,说明显微注射仪提供的平衡压力能够抵消培养液的虹吸效应,产生使基因液缓慢外流的正压。而在模拟显微注射过程中,连续按压数次显微注射仪的“inj”和“clr”键后,在注射仪提供的平衡压力不变的情况下,针内液面开始缓慢上升,说明原来的平衡压力已经不能抵消虹吸效应,使得培养液倒吸进入注射针,从而稀释针内的基因液,影响转基因动物制备的成功率。注射针的内径越小,其虹吸效应就越强,当基因液液面处于针的尖细部时,随着注射过程进行,液面不断向针尖方向移动,抵消虹吸效应所需的平衡压力就越高,这就需要在注射过程中时时调节“baln”的压力,这既增加了显微注射的困难度,而且实际上也不大可能实现。并且,使用该法仅能倒吸入少量基因液,在注射过程中,需要经常按压“clr”键（＞10次）来保证注射针口的通畅,在这个过程中会损失大量的基因液,导致吸入的基因液不足以完成一盘受精卵（20～30个）的注射量,增加了装载基因液的频率,亦会大大影响转基因实验的成功率。
3.2 b法的改良 本实验采用先从注射针背部装入适量石蜡油的方法（即b法）解决以上问题。在基因液装载的过程中发现,按压“fill”按键数次,石蜡油与基因液的交界面仍然可以上升,表明b法可以通过增加“fill”的次数来装入足够量的基因液,以保证顺利完成一盘受精卵的注射,从而节约注射时间。而在模拟显微注射过程中,连续按压数次显微注射仪的“inj”和“clr”键后,在注射仪提供的平衡压力不变的情况下,针内液面仍然缓慢下降,这说明只要石蜡油的上液面仍然处于注射针的直管部,即使基因液面在细管部移动,仍然不会影响抵消虹吸效应所需的平衡压力,因此连续按压数次显微注射仪的“inj”和“clr”键后,原来设定的平衡压力仍然能够产生使基因液缓慢外流的正压,消除了压力不稳定给转基因动物实验带来的影响因素。此外,由于石蜡油稳定、无毒、非亲水的特性,已被广泛应用于细胞培养的实验中,相对于高度提纯的基因液来说,石蜡油更加经济且易于获得。由于石蜡油的非亲水性,在基因液后端装上石蜡油可以防止溶液蒸发导致基因浓度升高,保持基因注射过程中基因液的正常浓度。且由于该操作的简便、无菌,在显微注射过程中可以重复装载基因液,毋需更换新的注射针,减少注射针使用量。用于装载石蜡油的微载管可以反复使用,也减少其用量。
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