作者：周伟进,蒋晓松,朱思平,佘雪霞
【摘要】 目的：探讨在新西兰大白兔梗阻性肾病的动物模型上解除梗阻后，红花注射液对促进肾功能恢复的机制。方法:将50只新西兰大白兔随机分为假手术组20只、模型组20只、治疗组10只。先建立梗阻性肾病新西兰大白兔动物模型，梗阻成功后，普通喂养4周，再次手术解除梗阻，治疗组向腹腔注射红花注射液，假手术组、模型组向腹腔注射生理盐水，2周后处死全部新西兰大白兔，提取肾组织行病理检查。检测血肌酐及尿素氮评价肾功能，评估药物的疗效，分析药物可能的作用机制及作用途径。结果:新西兰大白兔双侧输尿管梗阻后,肾功能明显减退,肾间质纤维化增加;运用红花注射液治疗后,肾功能显著改善,肾间质纤维化延缓。结论:红花注射液对新西兰大白兔梗阻性所致的肾功能损害解除梗阻后肾功能的恢复具有显著的保护及促进作用,该作用可能与红花其具有抗纤维化的作用有关。
【关键词】 红花注射液;梗阻性肾病;肾功能试验；兔
［abstract］ objective: to study the renal recovery effects of safflower injection on patients with obstructive nephropathy and its mechanism. methods: fifty new zealand white rabbit models of obstructive nephropathy were divided into fake operation group, model group, and treatment group with a ratio of 2∶2∶1. after a period of 4 weeks normal feeding, these rabbit models underwent operation to relive obstruction. then, intraperitoneal injection of safflower was performed on the treatment group, while saline on the fake operation group and model group. two weeks later, all rabbits were sacrificed. the renal tissues were extracted and analyzed. renal function markers including serum creatinine and urea nitrogen level were evaluated; curative effects and mechanism analysis were analysed. results: with obstructive nephropathy, the rabbits' renal function was obviously damaged with increased interstitial fibrosis. after given safflower injection the damaged renal function was obviously impaired; the process of interstitial fibrosis was delayed. conclusion: safflower injection possesses a protective and promotion function upon recovery of the damaged renal function caused by obstructive nephropathy in new zealand white rabbits. this effect is likely to be associated with antifibrosis effects of safflower.
［key words］ safflower injection; obstructive nephropathy; renal function; rabbit
梗阻性肾病因起病较为隐匿，初期由于无明显的临床症状，不易觉察病情，而到有临床症状时，肾功能多已发生了部分不可逆的改变［1］，即使是解除梗阻，依然存在一个慢性的、渐进性的肾损害过程［2］。WwW.11665.com因此，本实验研究红花注射液对新西兰大白兔梗阻性肾病的动物模型解除梗阻后，红花注射液采取何种有效的方法对促进肾功能恢复，有较大的临床意义。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂
红花注射液(50 mg/ml,山西康意制药有限公司,批号200021226)。肌酐检测试剂盒(roche公司),尿素氮检测试剂盒(roche公司)
1.2 主要仪器
全自动智能双探头y计数仪（sn67b型，上海）； 全自动低速冷冻多管离心机 （ddl 5型，上海）；多门低温冷冻冰箱（240 l，上海）；多功能双通道血液聚集仪（mpg 3d，上海）；电脑fg测定仪（fm 16 型，上海）；全自动生化分析仪（cl－8000，岛津株式会社）；亚光脱水机（2t－12p2，湖北）；生物组织包埋机 （ybl－ⅲ型，湖北）；leica切片机（rm2135，上海）；olympus显微镜（bx60，上海）。
1. 3 实验方案
1.3.1 分组并造模 动物：新西兰大白兔，共50只。雌雄各半，体重(2 000±200)g。随机分组：假手术组：20只；模型组：20只；治疗组：10只。
造模：（1）麻醉：用3％戊巴比妥钠（用量：1 ml/kg），耳缘静脉注入。（2）梗阻材料：银夹（外科手术止血常用材料，具有可塑性、良好的组织相容性）。（3）梗阻方法：麻醉成功后，取下腹正中切口，暴露膀胱及双侧输尿管下段，测量输尿管静息状态下的管径，将银夹连接部制成圆弧状，弧部直径＝1/2输尿管径）。将制作好的银夹套于双侧输尿管膀胱连接部以上1 cm输尿管上，达到缩窄双侧输尿管的目的，依次缝合各层（模型组及治疗组均依此法造模）。假手术组只分离输尿管下段，不夹银夹。
梗阻成功后，普通喂养4周。
1．3．2 解除梗阻 预实验已证实造模4周后，肾盂、输尿管明显扩张，肾实质变薄，实验室检查血肌酐及血尿素氮均较梗阻前明显升高，病理检查示：间质有炎症细胞浸润，肾小管有萎缩和坏死，间质面积增宽，纤维组织增生。
麻醉成功后，取原手术切口入路，显露输尿管下段，在不损伤输尿管的前提下取出银夹。假手术组同样经原手术切口入路，再次分离输尿管下段。
梗阻解除后，普通喂养2周。
1.3.3 施加干预因素 （1）治疗组：红花注射液（雅安三九药业有限公司，规格5 ml/支，用量：3 ml/kg，用法：腹腔注射，1次/d。（2）模型组及假手术组：生理盐水。用量：4 ml/kg，用法：腹腔注射，1次/d。干预因素从解除梗阻术后第1天施加，共2周。
周伟进等.红花注射液对梗阻性肾病解除梗阻后肾功能恢复的机制研究 1.3.4 资料采集 （1）记录一般情况：包括精神、活动情况、进食量、体重。
（2）实验室检查：①各组动物于手术前（当日）静脉抽血检测：血肌酐、血尿素氮。②在解除梗阻手术前（当日）各组动物均抽血复查血肌酐、血尿素氮。③在解除梗阻后2周，所有动物均抽血复查血肌酐、血尿素氮。
（3）病理检查:①造模4周解除梗阻前（当日），假手术组及模型组各处死10只动物，提取肾组织行病理检查。大体标本：肾脏的颜色、重量，肾盂扩张情况，肾实质厚度。光镜：肾组织石蜡切片，经he、pas染色后，观察肾小管间质病变，采用计算机图像分析系统测量肾皮质相对间质容积。免疫组化：采用sabc法。②解除梗阻后2周，处死全部动物，提取肾组织行病理检查。检查内容同前。
1.4 统计学处理
实验研究数据分别用spss软件包进行统计学处理，对所选标本进行二因素多水平方差分折方法。判定红花的疗效，分析其作用机制。
2 结果
2.1 各组大白兔血肌酐、血尿素氮水平
解除梗阻14 d后，治疗组血尿素氮、血肌酐水平均较模型组下降（p<0.05），治疗组肾功能恢复情况与假手术组近似（p>0.05），模型组血肌酐、血尿素氮水平均较其他两组高（p<0.05）。见表1、表2。表1 各组治疗前、后血肌酐水平表2 各组治疗前、后血尿素氮水
2.2 病理改变
(1)大体标本。①模型组与治疗组：大体标本形态近似，肾脏体积均增大，模型组肾脏颜色变浅，表面见暗红色小出血点，剖面示肾实质呈缺血状，以肾皮质为重，肾盂、肾盏重度扩张，肾实质变薄，皮髓质界限模糊。治疗组颜色较模型组红润，出血点减少，肾盂、肾盏轻－中度扩张，肾实质变薄，皮髓质界限较清晰。梗阻以上输尿管扩张。②假手术组：肾脏体积无增大，颜色红润，表面无出血点，肾盂、肾盏无扩张，皮髓质界限清晰。输尿管无扩张。
(2)光镜: ①模型组：系膜细胞及系膜基质增生,毛细血管受挤压变窄,肾小管上皮细胞萎缩或坏死，部分细胞落入管腔，管腔闭塞或扩张，大量淋巴细胞、单核巨噬细胞浸润，有肾间质纤维组织呈网状或片状增生，间质内见局灶性出血。②治疗组：肾小球毛细血管腔开放,部分肾小球系膜区轻度增宽,肾小管扩张,并有小片状灶性萎缩,可见间质纤维组织增生及炎症细胞浸润较模型组好转，间质内出血灶减少。③假手术组：肾小球、肾小管间质结构正常,上皮细胞无变性，间质未见炎症细胞浸润。
(3)肾小管间质病变程度：治疗组、模型组均有不同程度的病变，治疗组病变程度1级7例，2级3例；模型组2级7例，3级13例。两组与假手术组比较有显著性差异（p<0.05）。其中治疗组病变程度较轻，与模型组相比有显著性差异（p<0.05）。
3 讨论
红花性辛温,归心肝经,具有活血通经,祛瘀止痛的功效。红花注射液由红花提取有效成分精制而成,主要含有查耳酮类、漆树黄酮、山柰酚、桑色素、槲皮素和杨梅素等成分［3］。有报道,红花具有抗凋亡、抗凝、防止血栓形成及扩张血管等功效［4，5］。红花对心、脑等脏器缺血再灌注损伤的保护作用与其抗细胞凋亡有关［6，7］。
本研究表明, 梗阻性肾病是以梗阻为启动因素诱导产生。在梗阻因素去除后，运用红花注射液治疗，随着肾盂压力的减小，肾血流量得以部分恢复，残存肾单位的滤过功能逐渐增强。从本实验中还可得知，治疗组血清肌酐及尿素氮值明显降低，肾功能恢复的程度较模型组明显（p<0.05），接近于假手术组水平（p＞0.05），说明在梗阻解除后进行适当的治疗可以促进肾功能的恢复。在病理方面的变化较为明显，模型组、治疗组均有肾小管间质的增生，肾小管形态的改变，炎症细胞的浸润、间质的局灶性出血灶。假手术组肾小管排列紧密，整齐，小管间质内无炎症细胞浸润，肾间质无增生。间质损害程度的组间比较示：假手术组无间质损害，明显好于其他两组（p<0.05），治疗组好于模型组（p<0.05）。新西兰大白兔双侧输尿管梗阻后,肾功能明显减退,肾间质纤维化增加;运用红花注射液治疗后,肾功能显著改善,肾间质纤维化延缓。在肾间质纤维化过程中,随着纤维化的进展肾小管可肥大或萎缩,此种变化与肾小管上皮细胞的肥大和凋亡有关。目前已证明,肾小管上皮细胞的凋亡、转分化及分泌细胞外基质等,均参与了肾间质纤维化的过程［812］。同时,间质纤维化程度与细胞凋亡数量成正相关,提示上皮细胞的过度凋亡可能是肾小管萎缩的重要原因［13］。在正常肾组织中,成纤维细胞约占细胞总数的6%,而在纤维化改变的肾脏组织中,成纤维细胞约占细胞总数的60%,这些增加的成纤维细胞,与肾小管上皮细胞的表型转化密切相关［14,15］。表型转化是肾小管上皮细胞导致细胞外基质沉积的有一重要机制。唐蓉等［16］证实红花提取液是肾间质纤维化有效的负性调节剂。因此,红花注射液改善肾脏的血液循环,稳定肾小管上皮细胞,降低基质沉积等因素，导致肾间质纤维化得以延缓，有利于保护及促进肾功能的恢复。
综上所述,红花注射液对新西兰大白兔梗阻性所致的肾功能损害解除梗阻后肾功能的恢复具有显著的保护及促进作用,该作用与红花具有抗纤维化的作用有关，是红花注射液对促进肾功能恢复的重要分子机制之一。
【参考文献】
1 张旭东,许浩,李梅,等.奥曲肽在恶性肠梗阻非手术治疗中的应用［j］.实用临床医药杂志,2007,11(6):6162.
2 韩明福，董荣坤，张笃，等.超声刀在腹腔镜治疗黏连性肠梗阻中的应用［j］.宁夏医学院学报,2008,30(1):7475.
3 张戈,郭美丽,李 颖,等.不同品种红花黄酮类成分的hplc含量测定及其遗传稳定性研究［j］.中草药,2004,35(12):1411.
4 罗嘉,方治平,周黎明,等.红花注射液对大鼠局灶性脑缺血后梗死体积和神经元凋亡相关蛋白bcl 2,caspase 3表达的影响［j］.中国中药杂志,2004,29(10):977.
5 tzeng sh, ko wc, ko fn, et al. in hibition of plate letaggregation by some flavonoids［j］.thrombres,1991,64:91.
6 陈铎葆,郑为超,赵 辉,等.红花总黄素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心功能的影响［j］.中国中医药科技,2003,10(5):290.
7 罗嘉,周黎明,方治平,等.红花注射液对大鼠局灶性脑缺血后细胞凋亡的影响［j］.四川中医,2004,22(2):27.
8 liu d, razzaque ms, cheng m. the renal expression of heat shock prote in 47 and collagens in acute and chronic experimental diabetes in rats［j］.histochem j,2001,33:621628.
9 fan jm, ng yy, hill pa.transforming growth factor beta regulates tubular epithelialyofibroblast transdifferentiation in vitro［j］.kidney lnt,1999,56:14551467.
10 li jh, zhu hj, huang xr.smad7 inhibits fibrotic effcet of tgfbeta on renal tubular epithelial cells by blocking smad2 activation［j］.j am soc nephrol,2002,13:14641472.
11 jones s , jones s .regulation of renal proximal tubular epithelial cell hyaluronan generation lmplications for diabetic nephropathy ［j］.kidney lnt,2001,59:17391749.
12 江桂林,朱敏,孙志红,张悦.薄荷油湿热敷治疗粘连性肠梗阻的疗效观察［j］.实用临床医药杂志(护理版),2008,4(2):6263.
13 wang sn, hirschberg r. growth factor ultrafiltration in experimenatal diabetic nephropathy contributes to interstitial fibrosis ［j］.am j physiol renal physiol,2000,278:544560.
14 muller ga .renal fibroblast heterogeneity［j］.kidney lnt,1995,50:332336.
15 王玉,李晓玫.肾脏固有细胞的表型转化特征及其病理生理意义［j］.中国病理生理杂志,2002,22(6):569570.
16 唐蓉,杜胜华.红花对大鼠肾间质纤维化和肾功能的影响［j］.中国临床药理学与治疗学,2006,11(3):284.
