摘要：为修复中原油田石油污染土壤，采用优化原位微生物菌群辅以物理和化学方法与植物相结合的微生态技术，在试验区均匀加入了优化菌群制剂，并调控了土壤温度、氧和营养物质等，进行了土壤中石油的降解与修复试验研究。结果显示，土壤中修复初期平均石油含量在2 89825 mg/kg时，经过99 d的植物-微生物的修复技术，土壤中石油含量降解可达95%以上。验证了植物-微生物修复技术在中原油田土壤石油污染修复的有效性，探索了推广应用的可行性。
关键词：石油污染;植物-微生物修复;降解率
experimental study of microorganism and phyto-remediation for oil contaminated soil in central plains
zhang juan-juan1，2,zhang fa-wang2,chen li2,zhang sheng2, haoyan-zhen1
(1.shijiazhuang university of economics,shijiazhuang 050000,china;
2.institute of hydrogeology and environmental geology,cags,shijiazhuang 050061,china)
abstract: in order to remediate oil contaminated soil in zhongyuan oil field,micro-ecological techniques of optimized in situmicrobial communities and physical chemistry methods combined with plant were used for experimental studies on oil degradation and polluted soil remediation.in this experiment, optimized microbial populations were added into the experimental plots,and soil temperature（keep soil temperature above 25 ℃）,oxygen and other nutriments（control soil n,p,s,k,ca,mg,fe contents according to shares）were adjusted.the results showed that degradation rate can reach about 95% under oil average contents of 2 89825 mg/kg in the contaminated soil after for 99 days,which demonstrated the effectiveness of microorganism and phyto-remediation methods for oil contaminated soil in zhongyuan oil field.in addition it was discussed for feasibility application of the technique.
key words:oil contamination;microorganism and phyto-remediation;degradation rate
随着经济的快速发展，人们对石油的生产与消耗量不断增加。WWw.11665.cOm在石油勘探、开采、运输与加工等过程中由于操作不慎或偶然事故使相当量石油进入环境，导致土壤污染负荷日益加重［1-2］。如：80%以上的落地原油被截留在50 cm以上的表层土壤中［1］，逐渐积累导致土壤结构的破坏，影响土壤通透性，并对农作物的生长和发育造成很大的负面影响［2］。土壤石油污染的防治研究工作已受到人们的重视。如今已成立了一个全球土壤修复网络,包括北美、拉丁美洲、澳大利亚、非洲、亚洲和欧洲6个区域中心,其核心任务就是利用植物- 微生物系统原位治理污染环境,也就是植物修复( phytoremediation)［3-5］。
纯微生物方法修复缓慢，需要时间较长，往往与植物方法联合修复，辅以物理、化学方法，以微观效应改变宏观环境，即为微生物修复技术。该技术具有操作简单，费用低廉，场地适应性强，无二次污染等特点,有广阔的应用前景［6-7］。本文是在以往室内修复实验的基础上，将植物与微生物的方法联合起来，开展微生物技术修复中原油田石油污染土壤的研究，以期为石油污染土壤的生物修复提供科学依据。
1 试验区背景
试验场地位于中原油田濮阳市胡状乡原油严重污染的土地，土壤岩性为土黄色粉土土壤，土中含有少量2～10 mm的小砾石或小姜石，土壤湿容重172 g/cm3；自然含水量163%；ph为74；含盐量为1 243～18 650 mg/kg，表层土壤本底石油含量7677～5 0288 mg/kg,平均 2 89825 mg/kg。土壤下部25～50 cm，石油含量3136 mg/kg；ph为85；含盐量1 243 mg/kg。
2 试验材料和方法
① 菌剂及来源。试验菌剂，假单胞菌属（pseudomonas）、微球菌属（micrococcus）、放线菌属（actinomayces）、真菌（fungus）类的霉菌（mold）青霉属（penicillium）、毛霉（mucor）、曲霉属（aspergillus）等菌群，均为试验区油污土壤中筛选分离出的高效石油降解菌。将这些降解菌放大培养5～8 d后，测试菌液中含菌量为1011～1015个/ml，在修复工作前将培养好的菌液制剂存放于刷洗干净的25 l的6个塑料桶中。
② 配制营养液。mgso.4、nh.4no.3、cacl.2、fecl.3、kh.2po.4、k.2hpo.4。
③ 所需植物。根据刘继朝等人［8］在试验区所做的石油污染土壤修复试验效果，确定苜蓿作为本次修复植物。
④ 添加剂。麦糠麦秸、尿素和复合肥
⑤ 实验仪器： qzd-1型电磁振荡器、kq218超声波清洗器、生物恒温培养箱、高速离心机、高压蒸汽灭菌器、无菌实验室、生化培养箱、hz150l恒温摇床培养箱、奥林巴斯生物显微镜、752n紫外可见光栅分光光度计、电热干燥箱及各种化学分析用玻璃仪器。
⑥ 分析方法。石油、no.3-测定：为紫外分光光度法；nh.4+ 测定：为纳氏试剂比色法；ph： 用phb-3型ph 计；tds： 用ddb-303a 型电导率仪换算得出。土壤微生物细菌培养用《土壤微生物研究法》［9］，和参考文献［10-12］介绍的方法，细菌初步鉴定用《常见细菌系统鉴定手册》［13］中的方法。微生物鉴定：细菌按《一般细菌常用鉴定方法》［14］，真菌按《常见与常用真菌》［15］，放线菌按《链霉菌鉴定手册》［16］进行鉴定。
3 试验步骤
3.1 石油降解菌的分离与优选
自然界的物质循环微生物细菌的生化作用是非常重要的一环，碳的循环也不例外。许多细菌就是碳循环的主要驱动因子之一，机理就是在细菌的作用下，将碳氢化合物降解为co.2和h.2o的整个过程，也是自然界对石油污染的自净功能的生态效应，对土壤和地下水环境保护具有一定的实际意义。据此用细菌的选择性培养基和富集培养基，对中原油田濮阳徐镇镇一废弃采油井石油残留污染土壤的样品进行菌种、菌群的培养分离，选择优化出实验用降解土壤残油的菌种、菌群。本次试验选择优化出的细菌初步鉴定主要为：假单胞菌属、微球菌属、放线菌属、真菌类（毛霉、曲霉）等等菌群。
3.2 试验步骤
第一步，将待修复的场地经过拖拉机2次翻耕，3次旋耕，并平整；第二步，按10 500 kg/hm2，将准备好的麦糠麦秸均匀的撒到土壤表层，将尿素和硝酸磷钾复合肥均匀撒到修复土壤表层（尿素750 kg/hm2、硝酸磷钾复合肥375 kg/hm2），用拖拉机进行旋耕，深度尽量控制在25 cm左右；第三步，将配置好的菌剂用喷雾器按750 l/hm2均匀的喷洒在试验区（0.027 hm2）；第四步，按每亩750 l/hm2将配置好的营养液，用喷雾器均匀的喷洒在试验区；第五步，利用拖拉机反复旋耕，翻耕深度尽量控制在25 cm左右，使得修复土壤与麦糠麦秸、化肥、菌液和营养液混合均匀；第六步，将准备好的苜蓿籽播种在试验区；第七步，定期取样，测试修复土壤中石油含量、ph、含水量、土壤易溶盐、nh.4+ 、no.3-，取样方法采用同一深度的梅花状5分法，即在试验区内的东西南北中方位的同一深度各取同样量的土壤样，混合均匀后再行测试。
4 试验结果与讨论
4.1 修复土壤中菌群分布状况
在修复后第99 d分析试验区土壤微生物数量分布，结果见表1。
table 1 distribution of microbes numbers in soils samples after 99 days
试验前7.1×1053.6×1037.6×1052.8×1031.8×1041.8×102
试验后4.7×1085.5×1072.6×1071.6×1052.9×1055.2×103 由表1看出，修复后比修复前的嗜油菌高，其原因在于撒入的菌液含有大量的嗜油菌，且修复土壤中经过一段驯化能产生代谢污染物的能力,使原本不能够转化或转化非常慢的污染物被代谢降解,微生物的这种适应性促使嗜油菌数量增加［17］。
4.2 修复土壤中石油的去除率
分别在播种的第0 d(当天)、3 d、10 d、18 d、28 d、36 d、44 d、76 d和99 d取土壤样品测试，结果见表2。
table 2 results of oil contents and removal rate with time in the soils of plot
试验天数/d0310182836447699
石油含量/(mg·kg-1)2 898.2560.38155.0118.9848.2467.5648.63113.318.36
去除率（%）097.9294.6595.8998.3497.6798.3296.0999.37 由表2可知，第3 d降解率就达到了97%，这是由于加入的营养液、化肥、麦糠麦秸以及翻耕等综合作用，为原有土壤中的微生物提供了营养物质和氧气，激化了原有土壤中微生物对其中的石油的降解作用，修复至99 d时降解率达9937%，说明植物对污油土壤起到修复作用，这是因为苜蓿草中有根瘤，能为根部提供氮素营养可增加土壤细菌的活性，从而增加了其降解率。
4.3 修复过程对下层土壤的影响
修复第99 d，对试验区下部土壤50 cm深度处取样测试石油含量、易溶盐、nh.4+ 、no.3-、cl-含量，结果见表3。
table 3 oil contents,contents of soluble salt,nh.4+ and no.3-in plot after experiments
mg/kg污染物石油易溶盐nh.4+no.3-
修复前（对照）313.61 2439.1831.23
修复后700.061 190350.045.17 由表3可见试验区下部土壤石油含量有明显的增加，其他对照试验区像黑麦草试验区、黑麦草和苜蓿混合试验区中石油含量和初始相同深度土壤残油含量变化都不大，可能是取样时取到了石油团块，从而反映出土壤中石油的不均匀性；易溶盐、no.3-含量也可看出变化不是很大，也就是说no.3-氮、磷等易溶盐营养物质只有极小部分随水而进入下部土层。但是nh.4+的含量增高较大，有可能是种植苜蓿草的固氮作用，使加入的大量化肥进入下部。该结果为今后此类修复工作对营养物质的要求和添加方法具有重要的意义。
4.4 植物-微生物修复技术的控制因素
植物-微生物修复技术是利用原位土著微生物菌群，辅以物理和化学方法与苜蓿相结合的，应用该技术的关键是优化的微生物和地质环境的相互结合、相互依存、相互控制和调控。控制因素主要有温度、水、氧气、营养元素、地质环境的改善等等，该技术可用于环境的原位治理与保护，提高元素的转化，降解有毒、有害物质，以促进营养物质更易被生物所吸收。
4.4.1 土壤温度的调控
温度是影响微生物生长与存活重要因素之一，微生物的活动强度、生化作用都与此相关。温度的过高或过低都可抑制生长或导致微生物死亡，环境中的微生物均在一定的温度范围内生存，温度的适中可使细菌细胞中的生物化学反应速率加快。试验区强化的微生物菌群大多为中温微生物（13 ℃～45 ℃）， 25 ℃～38 ℃为最适生长温度。通过测试修复阶段地表的最高和最低温度显示，该地区地表最高温度在7月至9月大多为35 ℃以上，最低温度均大于20 ℃，昼夜温差不大。因此不用调控试验区土壤温度，修复效果也是很好的。但是如在其它季节就需要采取措施增温保温等。通过此次修复过程，也可得出在该地区开展微生态修复技术的最佳温度时期应在每年的6月下旬-9月中旬，使土壤温度保持在25 ℃以上，能保证微生物细菌的活力和繁殖力。
4.4.2 土壤中氧的调控
氧的供应成为微生物细菌降解有机物过程的重要调控因子之一。环境条件的调控包括氧气的供给，供氧量的多少能影响微生物细胞内许多酶的活性和细胞的呼吸作用，控制着微生物的生长和对有机物的降解能力。本次修复主要从4个方面对土壤氧的供给进行了调控，首先是充分翻耕试验土壤层，使其充分与大气混合。其次是保证试验土壤具有一定的含水量，使含水量保持在20%左右，水中提供的氧。另外，试验区土壤中添加了麦糠麦秸，该类添加剂不仅廉价易取，并能为土壤补充营养素，而且对修复层土壤进行了改良增大了蓬松性和通透性，使空气中的氧容易进入。加入的含氧营养元素k.2hpo.4、kh.2po.4、mgso.4·7h.2o、nh.4no.3、no.3-等也提供了大量的氧。上述调控措施为微生物降解土壤中的石油提供了充分的氧源。保证了微生物细菌在降解土壤中石油所需要的氧气。
4.4.3 营养元素的供给
营养元素是参与微生物细胞组成、构成酶的活性成分、物质运输系统以及提供生理活动所需的能量。微生物细胞的组成主要元素是c、h、o、n、p等等，其中c、h来自有机物如石油污染物。氧来自水和空气及其他调控的氧源。而氮和磷及s、k、ca、mg、fe微量元素等等作为营养物质需要进行补充和调控。因此，利用配置的营养液对试验区土壤进行了n、p、s、k、ca、mg、fe等元素的补充和调控；同时，尿素和复合肥中也含有所需的大量营养元素，以及添加的麦糠麦秸也补充其他生物素和营养盐。
5 结论
通过对石油开采区输油管线爆裂油层高盐水和原油严重污染的土壤的原位微生物与苜蓿草共同修复技术方法的实施应用，利用强化原位微生物菌群和种植苜蓿草辅以物理和化学方法与土壤环境相结合的生物生态技术，对修复区进行了土壤温度、水、氧气、营养元素、地质环境因素等等的调控，对土壤中残油的降解与修复实施，修复结果显示，土壤中修复初期平均石油含量在2 89825 mg/kg时，经过99 d的原位微生物修复，土壤中石油含量降解可达95 %以上。验证了微生物细菌与苜蓿草共同修复技术在中原油田土壤石油污染修复的有效性,探索了推广应用的可行性；并得出了该地区利用微生物生态修复技术的最佳时期应在每年的在6月-9月，通过调控可使温度在25 ℃以上；验证了本次试验调控添加的营养元素和土壤环境的改善是比较适度的，方法是可行的。但用于野外大面积修复还有待完善。它不仅可以在原位有效地修复土壤、包气带和阻控地下水的石油污染，而且还可以增加土壤的肥力改善土壤环境，尚无负面作用，对修复污染的土壤和农作物增产都具有重要意义，也是从根本上修复和治理土壤石油大面积污染的有效方法之一。
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