【摘要】 目的 在乙型肝炎病毒（hbv）所致的终末期肝病患者肝组织内，常可见大量的胆管增生，但其发生机制及临床意义尚不清楚。为阐明该类患者胆管增生的发生机制及其与卵圆细胞增生及肝细胞再生的关系，我们对8例hbv相关的终末期肝病患者及2例正常人肝组织进行了免疫组化染色及图像分析。方法 肝组织连续切片后进行免疫组化染色，观察指标为细胞角蛋白ck7、ck8、ck18、ck19、ov6、增殖细胞核抗原（pcna）、谷胱甘肽s转移酶（gstπ）、白蛋白（alb）及甲胎蛋白（afp）。结果 在所有8例患者肝组织汇管区内均可见典型增生的胆管及非典型增生的胆管，且对ck7、ck8、ck9、ck19、ov6及pcna染色呈阳性反应，但两种类型的胆管在染色强度上存在明显差异。一些非典型增生的胆管细胞表现出肝卵圆细胞的形态学及免疫组化特征。某些小型肝细胞样细胞在形态及免疫组化特征方面介于肝卵圆细胞及成熟肝细胞之间。结论 在hbv相关的终末期肝病患者肝组织内，胆管增生可能存在不同起源。某些非典型增生的胆管细胞实际上就是活化的肝卵圆细胞。非典型增生的胆管细胞与肝细胞再生密切相关。小型肝细胞样细胞可能是肝卵圆细胞与成熟肝细胞之间的中间过渡细胞。
【关键词】 肝病；胆管增生；肝干细胞；免疫组织化学
ductular proliferation in patients with hepatitis b virus induced end-stage chronic liver disease
chen yao-kai,qian yi-dan,wang yu-ming.
institute of infectious diseases,southwest hospital,third military medical university,chongqing 400038,china
【abstract】 objective ductular proliferation is frequently observed in the liver tissue sections of patients with end-stage chronic liver disease induced by hepatitis b virus (hbv),but its pathogenesis and significance remain unclear.in order to clarify the pathogenesis of ductular proliferation and its possible association with oval cell activation and hepatocyte regeneration,we performed immunohistochemical staining and image analysis of the ductular structures in the liver tissues from 8 patients with hbv-induced end-stage chronic liver disease and 2 healthy individuals.methods the liver specimens were sectioned serially,and then cytokeratin (ck) 7,ck8,ck9,ck19,ov6,proliferating cell nuclear antigens (pcna),glutathione-s-transferase,α-fetal protein and albumin were stained immunohistochemically.results typical type and atypical type of ductular proliferation were observed in the portal tracts of the liver tissues in all 8 patients.the proliferating ductular cells were positive for ck7,ck8,ck9,ck19,ov6 and pcna staining,however,typical proliferating ductular cells differed significantly from atypical ones in the intensity and extent of staining.some atypical ductular cells displayed the morphological and immunohistochemical characteristics of hepatic oval cells.some small hepatocyte-like cells were between hepatic oval cells and mature hepatocytes morphometrically and immunohistochemically.conclusion we conclude that the proliferating ductules in the liver of patients with hbv-related end-stage chronic liver disease may have different origins.some atypical ductular cells are actually activated hepatic oval cells.atypical ductular proliferation is related to hepatocyte regeneration and small hepatocyte-like cells may be intermediate transient cells between hepatic oval cells and mature heptocytes.
【key words】 liver disease; ductular proliferation; liver stem cells; immunohistochemistry
长期以来，已发现在慢性重型肝炎患者的肝组织切片中，除肝细胞大面积坏死、纤维组织增生、炎症细胞浸润及不同程度的肝细胞再生等病理特征外，还常有明显的胆管增生（ductular proliferation）现象，但这种胆管增生的本质及意义尚不清楚。Www.11665.CoM新近提出肝组织内胆管增生与肝干细胞活化、增殖可能有一定关系。我们对8例慢性重型肝炎及2例正常肝组织标本进行了免疫组化研究，旨在探讨慢性重型肝炎患者肝组织内胆管增生的性质及其与肝卵圆细胞活化、肝细胞再生的可能联系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 8例患者均为男性，年龄26～54岁，平均41.7岁。所有病例均为慢性重型肝炎患者，其中7例为乙型肝炎病毒（hbv）感染，1例为乙型肝炎病毒（hbv）与丁型肝炎病毒（hdv）重叠感染，诊断符合2000年9月西安第十次全国病毒性肝炎会议修订的诊断标准。所有8例患者均死于慢性重型肝炎，肝组织标本来自尸检或尸肝穿刺。2例正常肝组织为库存肝组织标本，取自无肝病史的正常男性成人。10例标本全部采用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片备用。
1.2 肝组织学检查 石蜡切片经脱蜡至水后，用苏木素-伊红染色，显微镜下观察肝组织结构及变化。
1.3 免疫组织化学染色 连续石蜡切片经脱蜡至水后，以3%过氧化氢溶液浸泡10min灭活内源性过氧化物酶；抗原胃蛋白酶或热修复后以正常山羊血清封闭，然后加第一抗体工作液4℃过夜；加生物素标记的第二抗体37℃ 45min；加结合过氧化物酶链霉亲和素37℃ 45min；加新鲜配制的dab，显微镜下观察5～10min，棕黄色染色为阳性信号；以pbs代替第一抗体作为阴性对照。单克隆抗体：鼠抗人细胞角蛋白ck7、ck19、ck8及ck18抗体为美国chemicon公司产品，小鼠抗大鼠ov6抗体由美国brown大学hixson教授惠赠，鼠抗人波形蛋白抗体为日本dako公司产品，鼠抗人增殖细胞核抗原（pcna）抗体、鼠抗人甲胎蛋白（afp）抗体、鼠抗人谷胱甘肽s转移酶（gstπ）抗体及鼠抗人白蛋白（alb）抗体为美国zymed公司产品。
1.4 细胞图像分析 采用重庆大学ict中心研制的tiger细胞图像分析系统，检测增生胆管细胞的细胞总面积（a）、最大直径 (dmax)、形态因子（dmax/dmin）及平均光密度（aod）。
1.5 统计学方法 计数资料均以（x±s）表示并进行均数t检验，以p＜0.05为差异具有显著性，p＜0.01为差异具有非常显著性。
2 结果
2.1 组织学检查结果 8例慢性重型肝炎患者肝组织内均见肝细胞大片坏死、大量淋巴细胞浸润、明显的纤维组织增生及胆汁淤积现象，4例见散在肝细胞增生灶，3例有假小叶形成；所有8例患者肝组织汇管区内均见明显的胆小管增生，有些已侵入肝实质内，而正常肝组织汇管区内仅见1～2条胆小管。
2.2 胆管增生的类型 从增生胆小管的结构看，慢性重型肝炎患者肝组织内存在两种类型的胆管增生：典型增生与非典型增生。前者表现为增生后的胆管有明确的边界和管腔结构，胆管细胞与周围细胞界线清楚，而后者表现为增生的胆管无明确的管腔结构，胆管细胞与周围肝细胞分界模糊（见图1）。但从细胞形态学特点上看，两类胆管细胞在细胞面积、最大直径及形状因子方面差异无显著性。
2.3 增生胆管的细胞表型 两种类型增生的胆管细胞对ck7、ck19、ck8、ck18、ov6及pcna染色均呈阳性反应，但两类胆管细胞的反应强度有较明显的差异。典型增生的胆管细胞对ck7及ck19呈强阳性反应而对ck8、ck18及ov6呈弱阳性反应（见图2）；部分非典型增生的胆管细胞对ck8、ck18及ov6呈强阳性反应而对ck7及ck19呈弱阳性反应（见图3）。采用细胞图像分析仪定量测定了两类胆管细胞对ck7、ck8、ck18及ck19的染色强度，结果有显著差异（见表1）。两者对pcna染色的阳性反应程度无明显差异。
表1 两类胆管细胞对ck7、ck8、ck18及ck19的染色强度（aod） （略）
注：* p＜0.001(t=7.010,5.966,6.897,6.078)
2.4 胆管增生与肝卵圆细胞的关系 增生的胆管细胞在形态上与肝卵圆细胞极为相似，具有细胞体积小、胞核大而细胞质少的特点，部分非典型增生的胆管细胞除具有ck7、ck19、ck8、ck18及ov6等胆管细胞表型外，还具有afp、gstπ等幼稚肝细胞表型，这种具有双重细胞表型的增生细胞完全符合肝卵圆细胞的形态及免疫组化特征。
2.5 胆管增生与肝细胞再生的关系 4例患者肝组织标本内见肝细胞灶性增生，增生的肝细胞体积及胞核大小不均，核仁显著，细胞质嗜碱性。其中少量肝细胞体积及形态介于肝卵圆细胞与成熟肝细胞之间，核浆比率较高，afp、alb及gstπ染色呈阳性反应且ov6染色亦为阳性，提示此类肝细胞来源于增生的胆管细胞或肝卵圆细胞（见图4）。肝卵圆细胞、小型肝细胞及成熟肝细胞的形态学参数见表2。
表2 肝卵圆细胞、小型肝细胞及成熟肝细胞的形态学参数 (略)
3 讨论
popper等最先使用“胆小管反应”一词来描述病变肝组织汇管区胆管上皮细胞的增生现象。胆小管反应亦被称为胆管增生，且增生的胆管是异质性的。在组织学上，增生的胆小管可被划分为典型增生的胆小管和非典型增生的胆小管。前者往往有明确的管腔结构、清楚的细胞边界，而后者往往缺乏明确的管腔结构且细胞边界模糊。胆小管（bile ductules）是连接于肝细胞间毛细胆管（bile canaliculi）与小叶间胆管（interlobular bile ducts）的那部分胆管。毛细胆管在肝组织内形成复杂的网络，最终汇成少数位于汇管区的胆小管。与毛细胆管相邻的终末支胆管是胆管树（biliary tree）的起始部位，由胆管细胞与肝细胞组成。由于毛细胞胆管在此处汇集，有些可呈轻度扩张状态。在正常肝组织内，汇管区仅可见少量胆小管，但在多种慢性肝胆疾病患者的肝组织内，胆小管有明显增生，如原发性胆汁性肝硬化（pbc）、原发性硬化性胆管炎（psc）、肝外胆管阻塞（ebo）及慢性肝炎（ch）等患者肝组织内均发现有胆小管大量增生［1～9］。胆小管增生在不同疾病中的发生机制及意义亦有所差异，但一般说来典型增生的胆小管起源于原有胆管，而非典型增生的胆小管来源较为复杂，与肝干细胞活化及成熟肝细胞蜕变（transformation）可能都有一定关系［1，4］。
本研究结果显示，终末期肝病患者肝组织内有明显的胆小管增生，增生的胆小管亦可分为典型增生与非典型增生两种类型，与上述多种慢性肝胆疾病肝内胆管增生有相似之处。为研究两者之间的差别，我们对两类胆管的细胞表型进行了研究，结果显示两种类型增生的胆管细胞对ck7、ck19、ck8、ck18、ov6及pcna染色均呈阳性反应，但反应强度差异有显著性。以上结果提示两类胆管具有不同的细胞起源，典型增生胆管与正常胆管对ck7及ck19都呈强阳性反应，表明该类型胆管起源于原有胆管，而非典型增生胆管对ck7及ck19呈弱阳性反应，对ck8、ck18及ov6染色反应则较强，表明该类型胆管与原有胆管的关系较远。正常肝组织内胆管细胞仅对ck7及ck19染色呈强阳性反应。
在通常情况下，肝再生由处于增殖静止期的分化肝细胞进入细胞周期而完成，但如果这一途径出现缺陷，部分胆管（hering管）上皮细胞可从门脉汇管区移出并分化为肝细胞，这种增生的胆管上皮细胞即是肝卵圆细胞。当肝细胞再生受损时，肝卵圆细胞的出现提示其来自于肝干细胞。终末期肝病是在慢性肝病的基础上出现肝细胞大面积坏死并进而发生肝功能衰竭的一种严重肝脏疾病，病死率极高，我们的统计为72.5%(306/422)。从理论上讲，终末期肝病患者肝组织内应有肝干细胞的活化、增殖及分化。首先，肝细胞大量坏死导致肝细胞数量急剧减少，因而肝脏有再生需求；其次，肝细胞坏死产生的大量毒素又抑制了残存肝细胞的增殖与再生。由此推断，终末期肝病患者肝组织内胆小管的大量增生有可能包括了肝卵圆细胞的活化与增殖。本研究结果显示，非典型增生的胆管细胞具有胆管细胞与肝细胞的双重表型，且具有肝卵圆细胞的形态学特征，提示至少有部分非典型增生的胆管细胞来源于肝干细胞，即部分非典型增生的胆管细胞实际上就是活化的肝卵圆细胞。我们的结果还显示，在终末期肝病患者肝组织内，胆管细胞与肝细胞再生存在一定的关联。第一，部分非典型增生的胆管细胞实际上就是活化的肝卵圆细胞，而后者最终可演变分化为肝细胞。第二，组织学及免疫组织化学结果均显示此类患者肝内存在肝细胞再生，部分增生的小肝细胞样细胞在特征上介于肝卵圆细胞与成熟肝细胞之间，提示小肝细胞样细胞由肝卵圆细胞分化而来，可能是肝卵圆细胞与成熟肝细胞之间的过渡细胞。
(本文图片见附页1）（略）
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