【摘要】 目的：研究真核化的原核表达系统——pcmvt7pol/pt7ireshbs双质粒共表达体系与常规真核表达质粒相比在真核细胞中的表达差异；基因免疫小鼠诱生特异性体液免疫应答的能力及二者所诱生的抗体亚型的差异。方法：运用分子生物学方法构建真核化的原核表达系统，将构建的质粒进行基因免疫，应用doteia和elisa等检测其所产生的抗体水平。结果：①真核化的原核表达系统在真核细胞中的表达能力明显强于常规真核表达质粒。②真核化的原核表达系统基因免疫小鼠不仅可诱生特异性体液免疫应答，且具有明显增强效应（p＜0.05）。③真核化的原核表达系统与常规真核表达质粒相比不仅可诱生同等程度的th1型免疫应答，而且能够诱生更强的th2型免疫应答（p＜0.01）。结论：真核化的原核表达系统——pcmvt7pol/pt7ireshbs双质粒能诱导较强的体液免疫应答。
【关键词】 真核化的原核表达系统 基因免疫 hbv
enhancing effect of eukaryonized prokaryotic expression system on hbv pres2/s gene immunization
yuan zhigang, zhang jinping, wang ying, chu yiwei, xu wei, xiong sidong.
department of immunology, shanghai medical college, fudan university, key laboratory of molecular medicine of ministry of education, shanghai 200032, china
［abstract］ objective:to investigate the difference of expression level between classical eukaryotic expression system and eukaryonized prokaryotic expression system made of pcmvt7pol and pt7ireshbs in eukaryotic cell environment.methods:eukaryonized prokaryotic expression plasmid was constructed and gene immunize was conducted with these plasmid;the antibody induced by these plasmid was evaluated by doteia and elisa.results:it was demonstrated that the eukaryonized prokaryotic expression system could efficiently enhance the expression level of target gene in eukaryotic cells. to further investigate the ability of eukaryonized prokaryotic expression system to induce hbv specific humoral immune response, mice were intramuscularly immunized with the mixture of the plasmid pcmvt7pol and the plasmid pt7ireshbs. it was demonstrated that hbv specific humoral response not only could be induced, but also was much stronger than that induced by the classical eukaryotic expression system. and the hbv specific th2 type immune response was greatly enhanced(p＜0.01).conclusion:eukaryonized prokaryotic expression system could induce stronger humoral response in vivo.
［key words］ eukaryonized prokaryotic expression system；gene immunization；hbv
基因免疫作为一种新的免疫接种手段自问世以来，已在抗感染免疫等方面取得了一系列较为满意的结果，其本质特征主要是将含编码目的基因的表达载体直接注射至机体局部，表达相应抗原，诱导机体产生特异性免疫应答。WWw.11665.cOm基因免疫的效果很大程度上取决于外源基因在宿主细胞内的转录和表达水平。因此，可以通过选择高效表达系统的方式提高外源基因的表达水平，有效增强基因免疫的效果。
基于t7 rna聚合酶与t7强启动子ф10间识别的特异性和高效性而建立的共表达体系，为目前最强大原核表达系统之一［1］。本室已通过联合采用以真核启动子cmv调控t7rna聚合酶的表达和在t7启动子下游插入脑心肌炎病毒mrna的核糖体结合位点（ires）两种方案，组成pcmvt7pol/pt7ires双质粒共表达体系，成功实现了原核表达系统的真核化［2］。那么，这一真核化的原核表达系统与常规真核表达质粒相比能否有效提高目的基因在真核细胞中的表达水平及增强基因免疫的效果呢？本研究中，我们拟以pcmvt7pol/pt7ireshbs双质粒共转染真核细胞株c2c12及以共注射方式基因免疫小鼠，并以常规真核表达质粒pcmvhbs为对照，探讨该真核化的原核表达系统与常规真核表达质粒在真核细胞中的表达差异及诱导hbv特异性体液免疫应答的情况。
1 材料与方法
1.1 实验动物 6～8周龄雌性balb/c小鼠，体重16～18 g，购自复旦大学上海医学院实验动物科学部，并在spf级动物房饲养。
1.2 细胞株 c2c12（c3h小鼠肌母细胞，atcc编号：crl1772）由本室保存。
1.3 主要试剂 hbsag纯品购自北京肝炎所；hrp标记羊抗小鼠igg、hrp标记羊抗小鼠igm、hrp标记羊抗小鼠igg1、hrp标记羊抗小鼠igg2a、hrp标记羊抗小鼠igg2b、hrp标记羊抗小鼠igg3（elisa效价均为1∶5 000）（美国southern biotech公司）；opd（sigma公司）。
1.4 质粒的构建和转染 质粒pvax1由美国fda dr. li惠赠；质粒pcmvt7pol由英国伦敦大学dr. eagles惠赠；质粒pcmvhbs和pt7ireshbs均由本室构建［2］。以pcmvt7pol/pt7ireshbs双质粒组成共表达体系，用脂质体共转染真核细胞或进行基因免疫，以仅转染pvax1，pt7ireshbs质粒作为对照。
1.5 基因免疫小鼠 于质粒dna免疫前24小时，以0.75%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，并在右腿胫骨前肌肉中注射100 μl 0.25%丁哌卡因，24小时后再次麻醉小鼠并在同一部位注射100 μg/100 μl质粒dna生理盐水溶液。基因免疫12周后，皮下注射hbsag（2 μg/只）加强免疫1次。隔周经眼眶后眦静脉采血，收集血清。
1.6 斑点酶免疫试验（doteia） 将转染细胞上清以负压装置抽滤于硝酸纤维素滤膜上，37℃湿盒收干1小时，以0.1 mol/l tris缓冲液（0.05%tween，ph 7.4）漂洗10分钟，以阻断液(0.1 mol/l tris缓冲液, 0.3%bsa)37℃阻断60分钟，trishcl缓冲液漂洗3次×5分钟，加兔抗人hbsag抗体，室温过夜，trishcl缓冲液漂洗3次×5分钟，加hrp标记的羊抗兔抗体，37℃湿盒孵育60分钟，trishcl缓冲液漂洗3次×5分钟，浸于dab底物液中显色。用dots点杂交图像分析系统对点膜样品进行灰度扫描，并进行统计分析处理。
1.7 血清中抗体的检测 以5 μg/ml hbsag纯品包板，37℃ 1小时，4℃过夜，弃上清，以pbstween20洗3次×3分钟，加入含5%小牛血清和5%山羊血清的封闭液37℃ 1小时，以pbstween20洗3次×3分钟，加入待测血清37℃ 1小时，以pbstween20洗3次×3分钟，加入hrp标记的羊抗小鼠二抗37℃ 1小时，以pbstween20洗3次×3分钟，加底物液37℃ 15～30分钟，以2 mol/l的h2so4终止反应，测od值。
1.8 统计学方法 采用spss统计分析软件进行t检验。
2 结果
2.1 真核化的原核表达系统表达能力强于真核表达质粒 为进一步探讨真核化的原核表达系统与常规真核表达质粒在真核细胞中的表达差异，本研究将pcmvt7pol/pt7ireshbs双质粒组成的共表达体系及pcmvhbs真核表达质粒分别用脂质体转染真核细胞株c2c12，每24小时收集一次细胞培养上清，共7次，然后以doteia方法检测目的基因hbsag的表达，见图1。结果发现：在转染24小时后，两者转染细胞的上清中即有目的基因的表达，但表达量并无明显差别；72小时以后pcmvt7pol/pt7ireshbs双质粒共表达体系目的基因的表达水平显著高于真核表达质粒pcmvhbs（p＜0.05）。这提示真核化的原核表达系统在真核细胞中的表达能力明显强于真核表达质粒，但是其表达量的增加需要一段缓冲期。
2.2 真核化的原核表达系统可诱生较强的hbv特异性抗体应答 pcmvt7pol/pt7ireshbs免疫组第1周即可检测到较为明显的抗hbsag特异性抗体的产生，至第4周达峰值；其抗体应答水平从第1周起持续高于真核表达质粒pcmvhbs免疫组（p＜0.05），见图2。进一步检测每组小鼠血清中特异性igm抗体和igg抗体的应答水平，发现pcmvt7pol/pt7ireshbs双质粒共表达体系不仅能够很好地诱生hbv特异性igm和igg抗体应答，而且对其应答水平比pcmvhbs免疫组提高2倍，见图3。表明真核化的原核表达系统基因免疫不仅能够诱导机体产生特异性体液免疫应答，且其诱生特性抗体应答的能力明显强于常规真核表达质粒。
2.3 真核化的原核表达系统免疫小鼠可诱生较强的hbv特异性抗体记忆性反应 从图4可以看出，pcmvt7pol/pt7ireshbs免疫组和pcmvhbs组均迅速出现二次抗体应答，且应答水平均显著高于初次基因免疫的应答水平（p＜0.01）；表现出较好的记忆性抗体反应，而空质粒pvax1对照组仅类似于一次蛋白初次免疫。pcmvt7pol/pt7ireshbs免疫组所诱生的记忆性体液免疫应答水平显著高于pcmvhbs免疫组（p＜0.05）。后者第22周时抗体应答水平达峰值（滴度1∶6 400），第24周开始呈现下降趋势，而pcmvt7pol/pt7ireshbs免疫组，抗体的应答水平至24周仍然呈明显的上升趋势，且应答水平较高，第22周抗体滴度达1∶12 800。这表明真核化的原核表达系统相比真核表达质粒能够诱生较好的特异性记忆性体液免疫应答。
图1 细胞上清中hbsag的表达（略）
fig.1 detection of hbsag expression in supernatant
note:a.doteia display(each dot with 200 μl sample);b.analysis by scanning.
2.4 真核化的原核表达系统诱生的hbv特异性igg抗体亚型
2.4.1 基因免疫诱生的hbv特异性igg1和igg2a抗体亚型免疫应答 对小鼠基因免疫后第4周血清中igg1和igg2a亚型进行比较分析，结果发现：①pcmvt7pol/pt7ireshbs诱生的igg1和igg2a亚型无显著性差别；而真核表达质粒pcmvhbs诱生的igg2a明显强于igg1（p＜0.05），见图5。②pcmvt7pol/pt7ireshbs免疫组与pcmvhbs免疫组相比，igg2a应答水平无显著性差别，而前者的igg1应答水平显著高于后者（p＜0.01）。
图2 小鼠血清中hbv特异性抗体应答（略）
fig.2 specific humoral response against hbv
note:dignostic sample was diluted into 1∶10 by pbs.
图3 小鼠血清中hbv特异性igm和igg抗体应答（略）
fig.3 detection of specific serum antibody igm and igg against hbv
图4 蛋白加强免疫后小鼠血清hbv特异性抗体应答（略）
fig.4 specific boosted humoral response against hbv
图5 基因免疫后第4周小鼠血清特异性igg1与igg2a抗体亚型应答（略）
fig.5 detection of igg1 and igg2a in serum from gene immunized mice
图6 第22周小鼠血清igg亚型滴度（略）
fig.6 detection of igg subtype in 22week immunized mice
2.4.2 蛋白加强免疫诱生的特异性igg抗体亚型记忆性反应 进一步对小鼠第22周血清中igg1、igg2a、igg2b和igg3亚型进行比较分析，结果发现：①与初次基因免疫相比，pcmvt7pol/pt7ireshbs免疫组与pcmvhbs免疫组的th1和th2型细胞免疫应答都得到了不同程度的提高。②pcmvt7pol/pt7ireshbs免疫组igg1抗体（滴度1∶12 800）水平显著高于pcmvhbs免疫组（滴度1∶3 200），igg2a抗体滴度（1∶400）是后者的（1∶100）4倍，而pcmvhbs免疫组igg2b抗体滴度（1∶3 200）高于pcmvt7pol/pt7ireshbs免疫组，两组igg3抗体应答无差异，滴度均为1∶400。③pcmvt7pol/pt7ireshbs免疫组，其igg1亚型抗体滴度（1∶12 800）显著高于其igg2a（1∶400）和igg2b（1∶3 200）的抗体滴度，而pcmvhbs真核表达质粒免疫组th1和th2型细胞免疫应答水平相近，其igg1、igg2a和igg2b抗体滴度分别为1∶3 200、1∶100、1∶3 200，空质粒对照组经蛋白加强免疫后，其igg1和igg2a抗体滴度分别为1∶3 200、1∶400，见图6。
3 讨论
由于t7 rnap与其启动子作用的特异性和高效性，pcmvt7pol/pt7ireshbs二者能在真核细胞内有效发挥协同作用，产生级联放大效应。我们以pcmvt7pol/pt7ireshbs双质粒组成的共表达体系转染真核细胞株c2c12，并以转染真核表达质粒pcmvhbs为对照，结果发现真核化的原核表达系统的表达能力明显强于真核表达质粒，其目的基因的表达水平可达后者的2～3倍。随着t7 rnap表达逐渐增多，t7启动子下游目的基因的表达也随着增加。这表明pcmvt7pol/pt7ireshbs双质粒共表达体系产生的级联放大效应对目的基因的表达明显优于真核启动子对目的基因的直接调控。这也是真核化的原核表达系统优于常规真核表达系统的主要原因，为异种蛋白基因在哺乳细胞中的高效表达及增强基因免疫的效果奠定了基础。
大量研究表明，基因免疫的效果是由多方面因素决定的，如基因疫苗导入的方法（肌肉注射法、基因枪法、皮内注射法等）、佐剂及辅佐分子的作用（如细胞因子、趋化因子、共刺激分子等）、肌注剂量、体积及所选质粒dna载体等因素［36］。其中，外源基因的表达水平（即载体的表达能力）是基因免疫效果的重要决定因素，而基因免疫所用的表达载体中的启动子启动目的基因转录的能力又是决定外源基因表达水平高低的主要影响因素。目前，基因免疫载体中的启动子有很多来源，如巨细胞病毒启动子cmv、rous肉瘤病毒启动子rsv、猿猴病毒40启动子sv40等，它们启动转录的能力各不相同，对外源基因的表达影响很大。dertzbaugh等［7］研究结果显示与其它启动子相比，cmv启动子始终表现出了很高的活性。我们的研究表明，真核化的原核表达系统所产生的级联放大效应，远优于真核启动子cmv对目的基因的直接调控［2］。
本研究中，我们以真核化的原核表达系统经肌肉基因免疫balb/c小鼠，发现该系统不仅能够诱生特异性体液免疫应答，且其应答水平显著强于常规真核表达质粒pcmvhbs免疫组免疫后第1周抗体免疫应答就显著高于pcmvhbs免疫组（p＜0.05），并可持续至少12周，第4周时igm和igg的抗体滴度是pcmvhbs免疫组的2倍多。我们认为，这可能是由于pcmvt7pol/pt7ireshbs被注射局部的肌肉细胞通过内吞的方式摄入胞内后，由于其形成的级联放大效应高于cmv启动子对目的基因的直接调控，从而大量表达外源基因，注射局部抗原表达量显著增多，这样被apc以外源性抗原识别并摄取后，进入mhc ⅱ类递呈途径的抗原量也相应增多，从而诱发较强的特异性体液免疫应答。
1995年，davis等［8］发现体液免疫动力学与所使用的表达载体有很大关系。bohm等［9］的研究表明，含不同启动子的编码hbsag的载体所引发的抗体应答有明显差别。其中具备cmv启动子的3种质粒，能够诱导高滴度的抗体水平，配备sv40启动子（含增强子）序列及逆转录病毒3′ltr序列的质粒诱生的抗体滴度较低（峰值比前三者低5～10倍）。由此，可以推测含不同启动子的编码hbsag的载体所诱发的抗体应答有明显差别。我们的研究表明，真核化的原核表达系统与常规真核表达质粒相比不仅可诱生同等程度的th1型细胞免疫应答，而且能够诱生更强的th2型细胞免疫应答。这提示真核化的原核表达系统对外源基因的表达方式、加工和递呈途径都与真核表达质粒pcmvhbs存在差别。
在本研究中我们也采用了primeboost的免疫策略，质粒dna免疫12周后以特异性抗原hbsag进行加强免疫，结果发现真核化的原核表达系统比真核表达质粒pcmvhbs免疫的效果更好，其抗体应答水平（第22周抗体滴度1∶12 800）显著高于后者（第22周抗体滴度1∶6 400）［10］。进一步分析小鼠蛋白加强免疫后血清中igg亚型（以第22周为代表），我们发现：与初次基因免疫相比，两组的th1和th2型细胞免疫应答都得到了不同程度的提高。但蛋白加强免疫后，每组小鼠的igg亚型抗体应答格局均表现为th2型细胞免疫应答的提高幅度高于th1型细胞免疫应答。即蛋白加强免疫后，每组小鼠产生的体液免疫应答均具有th2倾向性。我们认为这与以蛋白进行加强免疫具有很大的相关性。excler等［11］以dna primeprotein boost免疫策略进行hiv预防性疫苗研制的过程中也发现，这种免疫方式可诱生机体产生极高的体液免疫应答，而细胞介导的免疫应答（cmi）较弱。其它资料也表明，dna免疫和蛋白质免疫的相互交叉调节（crossregulation）作用可能更易诱导体液免疫应答的产生［1215］。在本研究中，我们发现真核化的原核表达系统基因免疫虽然不会改变蛋白加强免疫所诱生的th记忆性反应具有明显的th2倾向性这一格局，但这种倾向性与真核表达质粒相比表现得尤为突出。这可能是与真核化的原核表达系统初次基因免疫就具有提高th2细胞免疫应答水平这一优势相关，蛋白加强免疫后能将这种优势进行再放大，将这种差异体现的更为明显。
本研究中，我们发现真核化的原核表达系统诱生的特异性记忆性抗体免疫应答显著高于真核表达质粒，二者第22周抗体滴度分别为1∶12 800和1∶6 400。这表明真核化的原核表达系统基因免疫相比真核表达质粒诱生特异性抗体记忆性反应的能力较强。已知，记忆细胞的产生和维持是免疫记忆形成和维持的基础。因此，可以认为真核化的原核表达系统基因免疫相比真核表达质粒可能更利于b记忆性细胞（bm）的产生和维持。现已证实，滤泡树突状细胞（fdc）在bm细胞的产生和记忆维持中起重要作用，fdc是非吞噬细胞，即不能吞噬游离抗原，但其表面具有fc和c3受体可结合抗原抗体复合物，并长久地保留在细胞表面并保持抗原的天然状态［16］。因此，可以推测由于真核化的原核表达系统大量表达目的基因，就可能形成更多的抗原抗体复合物，进而更易于fdc相结合，从而利于bm细胞的产生和维持。当然，记忆免疫是一个十分复杂的问题，上述解释仅是基于目前研究结果上的一些推测，许多机制还有待进一步阐明。
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