【摘要】 目的：在体外构建并筛选出靶向线粒体转录因子a（tfam）的有效rna干扰慢病毒载体，用于大鼠整体rnai实验，观察其对肝组织中目的基因表达的干扰效果。方法：设计4条sirna序列并合成双链dnaoligo，制备目的基因rna干扰慢病毒载体，体外感染目的细胞，利用rt-pcr和western blot的方法检测目的基因tfam的表达情况，从而筛选出有效的干扰靶点。构建大鼠活体rnai动物模型，观察大鼠肝脏中靶基因表达的变化情况。结果：酶切鉴定及测序结果均提示sirna序列成功连接入载体中。rt-pcr结果提示3号靶点的干扰效率最高，达到了55％左右，western blot也验证了其干扰的有效性。大鼠活体rnai结果显示，肝脏中目的基因的表达也明显减少，这种表达减弱具有特异性和靶向性。结论：tfam靶向rna干扰慢病毒载体构建成功，能有效抑制目的细胞中线粒体转录因子a的表达。构建的慢病毒载体在大鼠活体内也具有良好的干扰效果。该研究为下一步利用此慢病毒载体进行活体rna干扰打下了基础。
【关键词】 靶向线粒体转录因子a·rna干扰·慢病毒载体·模型，动物·大鼠，wistar
establishment of experimental aminal model of rnai in vivo using lentivirus-sirna vector system targeting tfam
lin heng, tang chun, wu qiao, feng chun-lin, zhang yu-jun, bie ping
hepatobiliary surgery institute, southwest hospital, third military medical university （chongqing 400038, china）
【abstract】 objective: to construct a recombinant lentivirus vector of rna interference targeting mitochondrial transcription factor a （tfam） gene and to select the most efficient small interfering rna （sirna） to suppress tfam in target cells, and to use the selected lentivirus vector in vivo and to analyze its efficacy. methods: according to genbank information of tfam, four sirna and double strand dna were designed, synthesized and inserted into the lentivirus vector. the recombinant lentivirus vector system was confirmed by pcr and sequencing, then it was used to transfect the target cells. the change of tfam expression was determined by pcr and western blot. the most efficient lentivirus vector was selected and used in vivo. the change of tfam expression in liver was assessed. results: the results of enzyme digestion and sequencing showed that the recombinant lentivirus vector was constructed successfully. the result of rt-pcr showed that target 3# had the highest interfering. efficiency （about 55%） and western blot analysis confirmed its efficacy. the result of rnai in vivo also proved its efficiency. conclusion: the recombinant lentivirus vector of rna interference targeting tfam has been successfully constructed. it can effectively suppress tfam expression in vitro and in vivo.
【key words】 mitochondrial transcription factor a·rna interference·lentiviral vector·rats,wistar
rna干扰（rna interference，rnai）可用于生物学研究和药物研制，并可作为疾病的一种治疗手段。WWw.11665.COM现已发现一些有治疗作用的sirna［1］，但sirna如何有效地进入体内并传递到合适的靶器官和靶细胞尚不明确，文献报道，用于活体内传递sirna的方法包括化学修饰形成共轭体（如脂质体）［2］、与多肽、聚合物或抗体结合形成复合物［3］以及用病毒作为载体等。
本研究设计合成靶向线粒体转录因子a（mitochondrial transcription factor a，mttfa，tfam）的sirna，并利用慢病毒载体系统将体外实验筛选出的有效sirna通过门静脉传输至大鼠肝脏，观察其体内的干扰活性，从而构建出大鼠活体rna干扰实验动物模型，为下一步实验研究打下坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 动物来源及分组
健康wistar大鼠由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，雌雄不限，体质量180～250 g。动物分为阳性病毒组（实验组）、阴性病毒对照组和生理盐水对照组。
1.2 实验材料
慢病毒包装细胞293t细胞株、大肠杆菌菌株dh5α、及大鼠肝星状细胞株（hsc－t6）均由上海吉凯基因技术有限公司提供；慢病毒载体系统由pgc－lv载体、phelper1.0载体和phelper2.0载体3种质粒组成。taq多聚酶购自日本takara公司；lb培养基购自美国atcc公司；大量质粒dna抽提试剂盒购自美国qiagen公司；限制性内切酶ageⅰ、ecorⅰ、t4 dna连接酶及其缓冲液均购自美国neb公司；m-mlv逆转录酶、dntp、rna酶抑制剂均购自美国promega公司；pcr用试剂、引物购自上海吉凯基因技术有限公司；胰酶购自上海化学试剂公司；胎牛血清、dmem、rpmi1640及opti－mem均购自美国gibco公司；脂质体lipofect2000、总rna提取试剂trizol均购自美国invitrogen公司；山羊抗tfam、小鼠抗gapdh、抗山羊igg、抗小鼠igg均购自美国santacruz公司；bca protein assay kit购自美国hyclone-pierce公司；ecl-plus/kit购自美国amersham公司。
1.3 方法
1.3.1 构建慢病毒载体
针对目的基因tfam的基因序列，利用公用网站按照rna干扰序列的设计原则，设计了4个sirna的寡核苷酸序列（命名为target1#、target2# 、target3# 和target4#，具体序列见表1），并进行慢病毒载体的构建（双链dna具体序列见表2），然后运用t4连接酶与经过限制性内切酶ageⅰ、ecorⅰ双酶切后的pgc－lv载体连接，用氯化钙法制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞，转化大肠杆菌菌株dh5α，最后挑取阳性克隆进行pcr鉴定并进行测序分析。pcr鉴定阳性克隆的引物信息如下：上游引物：5’-cctatttcccatgattccttcata-3’，下游引物：5’-gtaatacggttatccacgcg-3’。
1.3.2 慢病毒载体包装及滴度测定
产毒细胞为293t细胞，将合成好的4个重组慢病毒质粒及辅助包装载体质粒进行高纯度无内毒素抽提，按照lipofectamine2000使用说明共转染293t细胞。转染8 h后更换为完全培养基，48 h后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液进行浓缩和收获，将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，－80 ℃长期保存。取其中1支进行病毒生物学滴度测定，方法为孔稀释法。具体病毒浓缩收获及滴度测定实验步骤参考文献[4]。
1.3.3 慢病毒感染目的细胞hsc－t6
将处于对数生长期的靶细胞进行胰蛋白酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为2×104），接种于12孔培养板中，37 ℃、5%co2 培养箱培养待细胞融合度达到约30%；根据moi值（moi=10，moi表示病毒数与细胞数量的比值），加入适宜量的病毒，12 h后观察细胞状态。如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24 h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基；感染3 d后观察慢病毒上报告基因gfp的表达情况，感染效率>50%者继续培养，待感染时间达到5 d后收集细胞抽提rna进行rt-pcr检测实验，感染7 d后收集细胞并采用western blot的方法检测目的基因蛋白水平的表达；感染效率<50%的实验组，重新进行感染实验。实验分为6组：con为正常目的细胞，未感染任何病毒的细胞组，nc为正常目的细胞，加阴性对照病毒感染的细胞组，kd为正常目的细胞，加rnai靶点病毒感染的细胞组，1～4标示待筛选靶点病毒的序号。
1.3.4 目的细胞中tfam rnai效果检测
1.3.4.1 rt－pcr检测目的细胞tfam mrna水平表达的变化情况
取各组细胞用trizol法抽提总rna，然后根据promega反转录试剂盒的操作说明将rna反转录成cdna。取1μl作为模板进行pcr反应，tfam上游引物：5’-agaaacgcctaaagaagaaagc-3’，下游引物：5’-ttccaagcctgatttacaagc-3’，扩增产物166 bp；内参照actin上游引物：5’-cggcattgtcaccaactg-3’，下游引物：5’-cgctcggtcaggatcttc-3’，扩增产物约369 bp。pcr反应条件：预变性95 ℃、15 s，之后每一步变性95 ℃、5 s，退火延伸60 ℃、30 s；共进行45个循环，每次在延伸阶段读取吸光度值。制作熔解曲线：pcr结束后，95 ℃变性1 min，然后冷却至55 ℃，使dna 双链充分结合。从55 ℃开始到95 ℃，每一步增加0.5 ℃，保持30 s, 同时读取吸光度值。real-time pcr数值分析采用2-δδct分析法。
1.3.4.2 western blot检测目的细胞tfam蛋白水平表达的变化情况
用2×lysis buffer（裂解液）冰上裂解细胞10～15 min，裂解液配方如下：1 mol/l tris-hcl（ph=6.8）100 mm、巯基乙醇 2％、甘油20％及sds 4％。测定蛋白浓度后，将每个样品蛋白终浓度均调整为2 g/l。各组取相同量总蛋白，采用sds-page电泳法电泳，湿转至pvdf膜，用含5％脱脂牛奶的tbst溶液封闭pvdf膜，山羊抗tfam抗体（1∶200）、小鼠抗gapdh抗体（1∶5 000）与封闭好的pvdf膜室温孵育2 h，tbst洗膜，相应二抗（1∶5 000）室温孵育pvdf膜2 h，tbst洗膜，最后采用ecl法进行显色。利用图像处理软件quantity one4.62对蛋白电泳图片进行分析，分别测定目的蛋白条带和内参照的吸光度值，并以二者的比值作为目的蛋白的相对定量结果。
1.3.5 大鼠活体rnai动物模型的建立
拟通过门静脉将慢病毒载体注入大鼠肝脏，为了保证慢病毒在大鼠体内的感染效率，我们在注射慢病毒之前进行了全肝血流阻断并参考文献[5]的做法将阻断时间定为20 min。具体方法如下：
1）实验组大鼠腹部用8％na2s脱毛，手术野用碘伏消毒，整个手术过程在双人双目显微镜下操作。进行全肝血流阻断时，先结扎右肾上腺静脉，然后依次阻断肝后下腔静脉、肝动脉和门静脉的血流，全肝血流阻断后立即通过门静脉注射rna干扰慢病毒载体（5×107 tu/只），阻断20 min后恢复血流。
2）阴性病毒对照组和生理盐水对照组手术步骤基本上和实验组相同，不同的是门静脉分别注射的是阴性对照病毒和生理盐水。
所有实验动物术前禁食12 h，麻醉采用乙醚吸入麻醉，术后自由进食水。各组观察时相点为术后4、7、14 d，保证每时相点每组存活大鼠6只。
1.3.6 目的基因tfam活体rnai效果检测
1.3.6.1 肝组织细胞感染慢病毒
术后各时相点取大鼠肝脏组织，制成1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小的组织块，用oct包埋剂包埋后反复多次于液氮中冻存（每次冻存时间为3～5 s），直至组织标本和包埋剂一起冻存成形，置于－80 ℃保存备用；将包埋好的标本切片，厚度为7 μm，置－20 ℃保存；切片取出后风干半小时，然后置于－20 ℃预冷的丙酮中4 ℃固定8 min；pbs洗3次，5 min /次；甩去多余的水分，dapi（1∶100）染核，水溶性封片剂封片，荧光显微镜下观察肝组织细胞感染情况。
1.3.6.2 rt－pcr检测肝组织中tfam mrna水平表达的变化情况
取各组液氮保存的肝组织标本，玻璃匀浆器制成匀浆后用trizol法抽提组织总rna，将rna反转录成cdna。取1 μl作为模板进行pcr反应。tfam上游引物：5’-taccctcgcctgtcagccttatct-3’，下游引物：5’-cacttcgcccaacttcagccattt-3’，扩增产物597 bp；内参照β-actin上游引物：5’-atcatgtttgagaccttcaaca-3’，下游引物：5’-catctcttgctcgaagtcca-3’，扩增产物约318 bp。pcr反应条件基本同前。real-time pcr数值分析采用2-δδct分析法。
1.3.6.3 western blot检测肝组织中tfam 蛋白表达的变化情况
取100 mg液氮保存的肝组织，加入1 ml ripa和10 μl pmsf（不能预先加入到ripa中，否则pmsf失去效能）冰上研磨组织块，研磨时避免起泡沫和发热；将样品转移至1.5 ml离心管，4 ℃、2 000 r/min离心30 min；将上清小心转移到无菌离心管中，取部分测定蛋白浓度，其余-20 ℃ 保存备用。其余实验步骤及分析方法基本同前。
2 结果
2.1 阳性克隆的pcr鉴定
靶向tfam的shrna寡核苷酸序列经退火形成双链dna，与经过限制性内切酶ageⅰ、ecorⅰ双酶切后的pgc－lv载体连接，连接产物转化dh5α大肠杆菌，挑取阳性克隆进行pcr鉴定。阳性克隆pcr产物大小为343 bp，而空载组pcr产物大小为306 bp，鉴定结果与预期一致。测序结果显示4个靶点均插入正确（图1，2）。2.2 慢病毒包装及滴度测定 使用重组慢病毒载体pgc-lv和慢病毒包装质粒phelper1.0和phelper2.0共转染293t细胞，48 h后收集病毒粗提液进行浓缩，命名为lenti-target1#、lenti-target2#、lenti-target3#和lenti-target4#。然后利用孔稀释法分别测定4个靶点的病毒滴度，结果依次为8×107、7×107、9×107和1×108 tu/ml，病毒包装成功符合下一步需要。
2.3 体外目的细胞中tfam rnai效果检测
2.3.1 rt－pcr检测目的细胞中tfam的干扰效果
rt－pcr结果显示，各组目的细胞tfammrna相对表达量（2-δδct）分别为，con：0.794±0.016；nc：1.002±0.075；kd1：0.853±0.063kd2：0.913±0.149；kd3：0.465±0.052；kd4：0.899±0.071。4个靶点中3号靶点对目的基因tfam的表达有明显干扰效果，干扰效率在55％左右（p<0.05）。
2.3.2 western blot检测tfam蛋白水平的变化
western blot结果证实3号靶点病毒感染hsc-t6细胞后，tfam蛋白水平的表达明显减弱，因此，该靶点是有效的rna干扰靶点（图3，4）。
2.4 目的基因tfam活体内rna干扰结果
2.4.1 肝组织感染病毒情况
通过肝组织冰冻切片观察到，门静脉注射慢病毒4 d后，实验组大鼠肝组织中就可以见到感染了慢病毒（带绿色荧光）的肝组织细胞（细胞核为蓝色，图5）；一直到胆道再通术后14 d，第3组大鼠肝组织中都可以见到感染了慢病毒的肝组织细胞。对心、脾、肺和肾等其它组织器官的观察可以发现这些组织细胞并没有感染慢病毒。
2.4.2 肝组织中目的基因tfam mrna水平的变化
rt－pcr结果显示，术后4 d，实验组大鼠肝组织中目的基因tfam的表达较2个对照组明显降低（p<0.05），干扰效率在45％左右，而两个对照组之间差异无统计学意义。至术后2周，实验组大鼠肝组织中tfam的表达仍然被明显抑制（p<0.05），说明在体外合成筛选的慢病毒载体在大鼠肝组织中能够较稳定的表达，并满足下一步实验的需要。
2.4.3 肝组织中目的基因tfam蛋白水平的变化
western blot结果显示，门静脉注射慢病毒后第4天，实验组大鼠肝组织中tfam蛋白表达也出现明显下降（图6）；至术后2周，实验组大鼠肝组织中tfam蛋白的表达仍然明显低于两个对照组，这一趋势与rt－pcr的结果一致，证明慢病毒载体在实验组大鼠肝组织中能够稳定表达并保持了良好的干扰活性。
3 讨论
tfam是影响线粒体dna（mitochondrial dna，mtdna）最重要的核编码因子之一，在mtdna的表达调控中处于中心位置，是mtdna维持稳定和转录所必须的因子。对mtdna的作用主要有以下几点：促进mtdna的转录及表达［6-7］；提高mtdna的拷贝数量［8］；修复受损的mtdna［9］；促进细胞的增殖及分化［10］。前期研究中发现，胆道梗阻后，重组人肝再生增强因子（recombinant human augmenter of liver regeneration，rhalr）对大鼠肝细胞线粒体功能及肝功能有明显的保护作用；当胆道再通后，给予rhalr的大鼠，其肝功能及线粒体功能恢复更快［11］。通过进一步研究发现，rhalr发挥作用可能与tfam有关：胆道梗阻后，rhalr能够降低tfam mrna表达量的下降；胆道再通后，rhalr能够促进tfam mrna表达量的增加。因此，笔者推测rhalr可能通过诱导梗阻性黄疸大鼠肝细胞tfam的表达，提高线粒体dna的拷贝数，保护及修复损伤的线粒体dna，从而最终发挥其对阻塞性黄疸大鼠线粒体功能和肝功能的保护作用。为了证明此推测，我们在动物活体上进行tfam的rnai，观察rhalr的保护作用是否依然存在。
sirna病毒载体系统中，常见的病毒载体有慢病毒、腺病毒和森林脑炎病毒等。其中慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组分和特性。利用慢病毒构建的sirna载体，与化学合成的sirna和基于瞬时表达载体构建的shrna相比，它可以用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。基于下一步动物活体rnai实验的需要，我们选择了慢病毒作为sirna的载体。体外实验结果显示，3号靶点在mrna和蛋白水平上都能明显降低tfam的表达，在设计的4个靶点中效率最高，达到了55％左右，且病毒滴度也满足下一步实验的需要。进一步动物实验结果显示，体外筛选出的有效干扰慢病毒载体通过门静脉注入大鼠肝脏后4 d，通过观察肝组织冰冻切片可以发现感染了慢病毒的肝脏细胞（其他组织器官中未发现表达绿色荧光的慢病毒），rt-pcr和western blot的结果也都提示目的基因tfam的表达明显降低，干扰效率在45％左右；至术后2周时，实验组大鼠肝组织中目的基因tfam的表达仍然明显低于2个对照组。结果说明，以慢病毒作为载体将sirna通过门静脉途径传输到肝脏后保证了其感染的特异性，体外筛选出的有效干扰靶点在体内同样保持了较好的干扰效果。因此，本实验筛选出的靶向tfam的有效sirna序列，构建的慢病毒载体传输系统及建立的大鼠活体rnai动物模型，为下一步研究rhalr保护阻塞性黄疸大鼠肝功能的作用机制打下了坚实的基础；同时，也为其他需要将tfam作为研究对象进行rnai的研究提供了参考。
【参考文献】
[1] de fougerolles a, vornlocher hp, maraganore j, et al. interfering with disease: a progress report on sirna-based therapeutics[j]. nat rev drug discov, 2007,6（6）:443-453.
[2] soutschek j, akinc a, bramlage b, et al. therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified sirnas[j]. nature, 2004,432（7014）:173-178.
[3] meade br, dowdy sf. exogenous sirna delivery using peptide transduction domains/cell penetrating peptides[j]. adv drug deliv rev, 2007,59（2-3）:134-140.
[4] 梁英，吴伟忠，李薇薇，等.靶向arnt的rnai慢病毒载体的构建及其在hcclm6中对arnt基因表达的影响[j].中国临床医学，2008，15（6）：879-882.
[5] ren b, o'brien ba, swan ma, et al. long-term correction of diabetes in rats after lentiviral hepatic insulin gene therapy[j]. diabetologia 2007, 50（9）:1910-1920.
[6] sheehan te, kumar pa, hood da, et al. tissue-specific regulation of cytochrome c oxidase subunit expression by thyroid hormone[j]. am j physiol endocrinol metab, 2004,286（6）:968-974.
[7] garstka hl, schmitt we, schultz j, et al. import of mitochondrial transcription factor a （tfam） into rat liver mitochondria stimulates transcription of mitochondrial dna[j]. nucleic acids res, 2003,31（17）:5039-5047.
[8] ekstrand mi, falkenberg m, rantanen a, et al. mitochondrial transcription factor a regulates mtdna copy number in mammals[j]. hum mol genet, 2004,13（9）:935-944.
[9] suliman hb, carraway ms, piantadosi ca. postlipopolysaccharide oxidative damage of mitochondrial dna[j]. am j respir crit care med, 2003,167（4）:570-579.
[10] takata k, inoue yh, hirose f, et al. spatio-temporal expression of drosophila mitochondrial transcription factor a during development[j]. cell biol int, 2003,27（4）:361-374.
