【摘要】 目的：评估腹腔冲洗细胞学检查和cea mrna检测对胃癌预后的临床意义。方法：收集胃癌及对照（胃良性疾病）组患者的腹腔冲洗液标本，进行腹水细胞病理学和cea巢式rt-pcr检测，并评价其与临床病理参数的关系。结果：腹水肿瘤细胞检测阳性率为30.3%，cea巢式rt-pcr检测阳性率为48.5%，其结果与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移和tnm分期有关（p<0.05），而与肿瘤的大小无关（p>0.05）。对照组腹水肿瘤细胞和cea检测阳性率均为0。结论：胃癌患者腹腔冲洗液cea mrna检测可作为判断胃癌侵袭转移、术后复发情况及患者预后的参考指标之一。
【关键词】 胃肿瘤·癌胚抗原·腹水·病理学，临床
clinical assessment and significance of cea mrna expression in peritoneal lavage for gastric cancer micrometastasis
an jie, liu wei, geng jian-ying, liu yan-li, zhang wen, li hui
department of pathology, department of hepatobiliary, bethune international peace hospital, chinese people's liberation army
shijiazhuang 050082, china
【abstract】 objective: to evaluate the significance of peritoneal lavage cytology and cea mrna detection for clinical assessment of prognosis of gastric cancer. methods: peritoneal irrigating solution samples in 66 patients with gastric cancer and 12 innocent ones were collected, peritoneal lavage cytology and cea mrna nest-rt-pcr detection were used to exam the exfoliated cancer cells, meanwhile relationships between positive results and relative clinico-pathological parameters were evaluated. results: the positive rate of he was 30.3%, and that of nest-rt-pcr was 48.5%. when the degree of histologic differentiation of gastric cancer became poorer, deeply invasion increased, stage of tnm upgraded and lymph node metastasis appeared, positive rate in peritoneal lavage increased significantly （p<0.05）. but it was not related to the size of the tumor（p>0.05）. conclusion: the methods may act as the standard for judging the invasive and metastatic state of gastric cancer and forecasting the prognosis of patients with such disease.
【key words】 stomach neoplasm·carcinoembryonic antigen·ascites·pathology，clinic
腹膜种植转移是影响胃癌患者预后的主要原因之一。WWw.11665.coM胃癌患者就诊时多已处于浆膜受侵的进展期，半数以上患者最终死于腹膜种植转移［1］。因此，及时发现腹膜微转移并予以治疗是提高胃癌存活率的重要环节。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，cea）是用于标记上皮源性肿瘤的常用抗体，本研究的目的在于通过检测腹腔冲洗液cea mrna，探讨其对胃癌微转移的意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
胃癌患者腹水或者腹腔冲洗液标本66例，术后均经病理组织学明确诊断。男42例，女24例，年龄41~65岁，中位年龄55岁。对照组12例，病理证实均为胃良性疾病，男7例，女5例，年龄22~52岁，中位年龄37岁。对照组为良性胃溃疡疾病患者，采用开腹手术，均取腹腔冲洗液标本以备检测。所有入选病例术前均未行放、化疗。66例中早期胃癌6例，乳头状腺癌2例，管状腺癌6例，低分化腺癌46例，粘液腺癌6例；伴淋巴结转移者34例，无淋巴结转移者26例。依胃癌组织分化程度将其归为2大类：早期胃癌、乳头状腺癌、管状腺癌为分化较好组；低分化腺癌、黏液腺癌为分化较差组。胃癌病理诊断参照1980年全国胃癌协作会议制定的标准，病理组织学分型及ptnm分期分别根据世界卫生组织（who）和1999年日本《胃癌外科病理处理规约》颁布的方案实施［2-3］。
1.2 试剂
trizol抽提试剂（roche公司），rt-pcr试剂盒（promega公司），操作步骤按试剂盒说明进行。
1.3 方法与步骤
1.3.1 标本的收集
以电刀开腹，尽量避免出血，若有腹水则直接吸出；如无腹水，注入150 ml无菌生理盐水，冲洗胃肿瘤表面，于douglas窝置入16号导尿管，轻轻搅动后吸出，收集后加入12 500 u肝素抗凝离心。
1.3.2 腹腔液脱落细胞检查
标本收集后在30 min内初步处理，1 500 r/min 离心10 min，弃去上清液，pbs液冲洗管内的沉淀细胞，2 000 r/m离心5 min，弃去上清液。然后将所得标本分为2份，一份离心后沉渣涂片，先置于1%冰醋酸乙醇溶液中5 min，以破坏红细胞，然后行he染色；一份离心后，进行巢式rt-pcr检测。
1.3.3 腹腔液细胞形态学观察
将细胞沉渣涂片、风干；95%乙醇固定10 min，pbs洗涤3次，每次5 min；浸入苏木精染液中染色5~10 min，自来水浸洗3次，每次5 min；浸入稀盐酸乙醇溶液分色数秒，自来水浸洗3 min；浸入淡氨水中使胞核蓝化3~5 min，自来水浸洗5 min；浸入伊红染液中染色5~10 min，梯度乙醇脱水，每次1 min；中性树胶封片，镜下观察并摄像记录。
1.3.4 腹腔液cea mrna巢式rt-pcr检测
提取细胞总rna，冷浴备用，吸取所需要的体积，添加oligo（dt）16引物，用预冷的nuclease-free water补足体积，70 ℃保温5 min，冷水浴5 min，按反应个数计算所需反应混合物体积，顺序加入各反应试剂并轻轻混匀，注意防止交叉污染。将反应管置于25 ℃、5 min，42℃、1 h，70 ℃、15 min。然后开始2轮pcr扩增。引物由上海生工生物技术有限公司合成，cea巢式引物包括：a（sense 1）：5’-acagatggtgcatcccctggcagag-3’，b（anti-sense）：5’-acggttgccatccactctttcac-3’，c（sense 2）：5’- aaccttc-3’。内参β-actin引物：5’-ggcatcgtgatggactccg-3’；5’-gctggaaggtggacagcga-3’。cea首次pcr扩增引物为a和b，反应参数：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，反复30个循环；72 ℃、5 min，4 ℃、5 h。取第一轮pcr反应产物，稀释100倍后作为模板，进行第二轮pcr反应，cea扩增引物为b和c。第一、二轮pcr反应条件相同（退火温度除外）。灭菌蒸馏水代替总rna的反应体系进行逆转录和pcr扩增作为阴性对照。各样本β-actin作为内对照。rt-pcr最终产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
1.3.5 判断标准
rt-pcr凝胶电泳后以quality one凝胶成像及分析系统进行观察和分析。cea mrna阳性者可见173 bp条带，β-actin扩增产物为613 bp，β-actin阳性样本视为有效样本。
1.3.6 统计学处理
采用spss10.0统计软件，率的比较应用χ2检验或fisher精确概率计算法（双侧）；计量资料采用t检验，相关分析采用spearman检验。p≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 腹水细胞he染色观察
正常间皮细胞常表现为单个散在，即使成团也表现为平铺状；核通常为单个，位于细胞正中或偏位，染色质细腻，无核仁或有1~2个小核仁；增生的间皮细胞排列成团，出现双核或多核，核增大，核质比例增大但一般不会出现失调（图1 a）。腺癌细胞在涂片中多成团分布，细胞之间可紧密排列成三维立体结构，但也可为单个散在；癌细胞核大、深染、形状怪异，染色质粗，核浆比例倒置；胞质可有空泡，有的病例可见明显推挤核，呈印戒样；分化较好的癌细胞核异型性不大（图1 b）。66例胃癌标本中20例癌细胞检测阳性，阳性率为30.3%。对照组检测阳性率为0。
2.2 cea mrna巢式rt-pcr检测
标本第一轮β-actin 基因pcr扩增产物为613 bp，β-actin阳性样本视为有效样本，随后进行第二轮扩增。cea巢式rt-pcr扩增产物为173 bp。阳性对照胃癌mkn45细胞在173 bp处可见明亮特异性扩增条带出现。对照组12例β-actin表达率100%，未见cea mrna扩增条带出现。66例胃癌患者腹腔冲洗液标本中，32例可见cea特异性扩增条带，表达阳性率 48.5%。阴性对照无特异性条带出现（图2）。统计学分析提示，胃癌患者腹腔冲洗液 he检测及cea mrna表达与肿瘤分化程度、肿瘤的浸润深度、淋巴结转移和tnm分期有关，而与肿瘤的大小无关（表1）。
3 讨论
胃癌术后腹膜种植转移是影响胃癌患者预后的重要因素之一，约有47%~50%的胃癌患者术后死于腹膜种植转移与复发［4］，其主要原因在于腹腔内存在游离癌细胞或残存微小病灶种植于腹膜上［5］。患者腹腔内游离癌细胞的存在是“潜在性腹膜转移”的病理学基础，也是术后患者腹膜种植与复发的主因。
3.1 游离癌细胞的来源及影响因素
胃癌患者腹腔游离癌细胞的来源主要是癌灶本身。侵及胃浆膜的癌灶由于癌细胞间黏附力降低可脱落入腹腔，形成腹腔游离癌细胞［6］。本研究表明，胃癌侵犯浆膜的病例腹腔游离癌细胞阳性率明显高于浆膜未受侵者，提示进展期胃癌浆膜侵犯与腹腔脱落癌细胞形成直接相关。
胃癌淋巴结微转移灶及术后离断淋巴管也使肿瘤细胞逸出，形成游离癌细胞，致使腹腔复发转移［7］。本研究结果显示，胃癌发生淋巴结转移的病例，其腹腔游离癌细胞阳性率明显高于淋巴结未发生转移者，提示胃癌淋巴结转移与否及转移程度与腹腔脱落癌细胞形成亦密切相关。
腹腔游离癌细胞阳性率与胃癌大体类型及分化程度有直接关系。李东印等［8］报道胃癌borrman分型中，ⅰ/ⅱ型胃癌腹腔游离癌细胞阳性率为9%，ⅲ/ⅳ型为35%；此外，肿瘤分化程度愈差，腹腔游离癌细胞的阳性率愈高；胃癌侵及浆膜面积愈大，腹腔游离癌细胞阳性率愈高。本研究结果与文献报道基本一致。
3.2 游离癌细胞的种植条件
1996年，sugarbaker［9］提出了著名的肿瘤细胞诱捕学说（tumor cell entrapment hypothesis），即腹腔游离癌细胞形成腹腔微转移灶，从而导致腹腔恶性肿瘤术后早期复发转移的理论。胃癌术后腹腔游离癌细胞种植须具备相应条件：一是游离癌细胞具有较高的侵袭能力（种子）；二是应有适宜癌细胞种植的“土壤”。
birbeck和wheatley早在1965年用电子显微镜观察游离癌细胞腹膜种植的过程，发现当腹膜的间皮细胞脱落时，出现间皮下的结缔组织裸露区，游离癌细胞易在此裸露区种植［10］。
3.3 游离癌细胞的检测
胃癌患者腹腔游离癌细胞可通过收集腹水或腹腔冲洗液获得。早在40年前，keettel和elkins率先采用腹腔冲洗法收集卵巢癌患者的腹腔游离癌细胞［11］。胃癌患者的腹腔游离癌细胞检测开展较迟。国内陈峻青［12］于1979年首次开展了这方面的研究工作。腹腔冲洗液的收集一般是在开腹后收集腹水50～100 ml，无腹水时采用100～200 ml生理盐水冲洗腹腔后收集冲洗液而获得。各文献报道的的腹腔冲洗范围有所不同：有些采用上腹部冲洗法，即仅冲洗横结肠以上区域，包括胃的浆膜、隔下及肝下陷窝；有些用温盐水冲洗全腹腔，而后置患者于头高足低位再收集douglas窝处的冲洗液，收集的冲洗液经离心沉淀后涂片染色即可镜检。近20年来，日本等国外学者逐渐把胃癌患者腹腔冲洗液中游离癌细胞的检测作为重要的筛查指标进行，kostic等［13］对100例胃癌患者行腹腔灌洗细胞学检测，其阳性率为24%，chuwa等［14］报道检出率为25.4%，kodera等［15］报道阳性率为24%～39%。本研究中细胞学检测癌细胞阳性率为30.3%（20/66），与国外报道基本相符。
rt-pcr方法被广泛应用于各种实体肿瘤微转移检测，巢式rt-pcr进一步改善了原有技术的不足，采用2对以上的引物扩增目的片段，与传统rt-pcr相比，检测的敏感性和特异性都明显增加，可检出107个细胞中的1个肿瘤细胞［16］。kodera等［15］报道，胃癌患者的随访，以术后出现腹膜复发为观察终点，plc诊断腹腔游离癌细胞的敏感性和特异性分别为56%和91%，rt-pcr的敏感性和特异性分别为80%和94%，其检测效果显然优于前者，但采用mrna检测有增加假阳性结果可能。
cea存在于多种上皮性肿瘤细胞中，是用于标记上皮源性肿瘤（主要为胃肠道、卵巢肿瘤）的常用抗体，多因素分析提示腹腔冲洗液cea mrna水平是胃癌腹膜复发的重要危险因素之一，临床上将其作为胃癌筛查的重要参考指标［2］。腹腔冲洗液cea mrna和细胞学检查一样，是检测腹腔游离癌细胞的有效方法［15，17-18］。临床随访也证实了胃癌患者体内cea检测能够更好地预测有无腹腔播散，是判断胃癌预后的独立因素，同时为术后有目的的治疗提供依据。本研究在对患者术后进行的短期随访中，行腹腔灌洗收集冲洗液进行病理细胞学及cea mrna的测定，有条件者行腹腔镜下腹膜活组织检查及收集腹腔冲洗液，以便于尽早发现复发胃癌，及时干预治疗。在临床实践中，胃癌患者术后给予定期化疗的同时，对于上述检测值明显升高，高度怀疑腹膜种植或复发的病例应辅以腹腔灌注化疗，以抑制胃癌发生腹膜种植的发生，并随访长期疗效。
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