肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统的构建的论文_肿瘤论文

【摘要】 目的利用婴儿双歧杆菌对实体瘤低氧区的靶向效应，构建肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统ptrkh2pst /cd和ptrkh2pst /uprt。方法用pcr的方法从质粒pgex/cd和pgex/uprt中扩增出cd基因和uprt基因，双酶切cd基因、uprt基因和质粒ptrkh2pst，分别连接后重组于大肠杆菌中。之后用电转化的方法将重组质粒转入婴儿双歧杆菌中。用rtpcr检测该系统mrna水平的表达，sdspage检测该系统在蛋白质水平的表达。在黑色素瘤b16f10细胞上检测该系统的体外肿瘤细胞杀伤效果。结果成功地将cd基因和uprt基因转入了质粒ptrkh2pst，cd基因和uprt基因的测序结果表明序列与genebank公布的序列一致。rtpcr检测到cd和uprt mrna水平的明显表达。在含有cd基因的婴儿双歧杆菌细胞全蛋白中发现了cd蛋白质的表达，在含有uprt基因的婴儿双歧杆菌上清液中发现了uprt蛋白质的表达。黑色素瘤细胞的低存活率证明了ptrkh2pst/cd、ptrkh2pst/uprt自杀基因治疗系统对黑色素瘤的显著杀伤作用。结论肿瘤厌氧靶向双自杀基因治疗系统ptrkh2pst/cd、ptrkh2pst/uprt构建成功并显示出杀伤肿瘤细胞的作用。

【关键词】 婴儿双歧杆菌；自杀基因；cd基因；uprt基因；肿瘤靶向性

construction of anaerobic infant bifidobacterial mediated ptrkh2pst/cd and ptrkh2pst/uprt dual suicide system for tumortargetting gene therapy

ye peng1, li zhuhua2, yang yanbiao3, wang shuren1

1. department of pathophysiology, west china school of preclinic medical sciences and forensic medicine, sichuan university, chengdu 610041, china；2. department of pathophysiology, luzhou medical college；3. the first people's hospital of lanzhou

corresponding author：wang shuren, email:[email protected]：objective to construct ptrkh2pst/cd and ptrkh2pst/uprt dual suicide gene therapy system into tumorhypoxiatargeting carrier of infant bifidobacterium.methodscd gene and uprt gene were amplified from pgex/cd and pgex/uprt by pcr. the cd gene, uprt gene were inserted into lactic acid expressing plasmid ptrkh2pst, then constructed two recombinant plasmids of ptrkh2pst/cd and ptrkh2pst/uprt were introduced into bifidobacterium using electroporation. the expression of cd and uprt in bifidobacterium were detected by rtpcr or through sdspage and silver staining. the killing effects of ptrkh2pst/cd and ptrkh2pst/uprt suicide gene therapy system on melanoma b16f10 cells were measured using methyl thiazolyl tetrazolium (mtt) assay.resultsthe cd gene and uprt gene was successfully recombined into plasmid ptrkh2pst. the sequencing results of cd gene and uprt gene in dual suicide system are consistent with data in genebank. both mrna and protein level of cd and uprt were effectively expressed in gene recombinant infant bifidobacterium. the survival rate of melanoma b16f10 cells treated with cd/uprt and 5fc ranged from 1.7%~13.3%, while the rates in control, cd and uprt groups ranged from 81.3%~91.7%,26.7%~58.3% and 78.3%~86.7%, respectively.conclusioncd gene and uprt gene were successfully inserted into ptrkh2pst vector and effectively recombined into infant bifidobacterium. this dual suicide gene therapy system showed a powerful killing efficiency on tumor cells.

key words：bifidobacterium infantis；suicide gene；cd gene；uprt gene； tumortargeting
1材料与方法

1.1材料质粒ptrkh2pst由复旦大学生命科学院黄教授赠予，婴儿双歧杆菌2001株由四川大学华西口腔医学院赠予，质粒纯化试剂盒和pcr产物纯化试剂盒购自omega co.，pcr反应试剂盒和dna marker购自promega co.(usa)，bamh i,sal i购自takara co.，其他试剂均为国产分析纯。wwW.11665.COm

1.2方法以纯化质粒pgex/cd和pgex/uprt作为pcr反应的模板。根据cd基因在genebank(nc0009131)中的序列设计引物，上游引物为：5′ccgggatccctaacaatgtcgaataac3′，下游引物为：5′gtggtcgacgaattctgtaacccagtc3′。根据uprt基因在genebank(x57104)中的序列设计上游引物为5′gggatccatgaagatcgtggaagtc3′，下游引物为：5′gtggtcgacgaattctgtaacccagtc3′。pcr反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，重复30次。用bam h ⅰ和sal ⅰ对cd基因、 uprt基因、ptrkh2pst质粒进行双酶切。之后通过t4 dna连接酶的作用将cd基因和uprt基因分别连接在ptrkh2pst质粒上。大肠杆菌的转化过程参照《分子克隆实验指南》相关章节所述步骤。将转化后的菌液加到含有150μg/ml红霉素的bhi固体平板培养基上，37℃孵育16h，如文献 [5]中所推荐。挑出阳性菌，纯化质粒并用电泳，双酶切和基因测序的方法验证其正确性。婴儿双歧杆菌的电转化过程是根据alessandra argnani描述的步骤进行[6]。转化成功后，阳性菌液提纯质粒并通过电泳和测序的方法检验。通过rtpcr的方法检测cd、uprt基因在mrna水平的表达情况，之后用电泳的方法鉴定结果。通过提取含有ptrkh2pst/cd或ptrkh2pst/uprt质粒的双歧杆菌全细胞蛋白进行sds聚丙烯酰胺凝胶电泳（sdspage）的方法进行分析在蛋白质水平的表达情况，结果用银染法显色鉴定。对照组不含质粒的双歧杆菌，分别含cd基因、uprt基因的双歧杆菌，以及含cd基因、uprt基因双歧杆菌的混合液分别被接种于4组mrs培养基中，37℃培养过夜后每组均加入终浓度为0~100mmol/l的5fc(5氟胞嘧啶)，于37℃继续培养24h后，上清液真空干燥，加入1ml生理盐水溶解残渣并过滤制成处理液。鼠黑色素瘤b16f10细胞培养于96孔板中。当细胞铺满60%~70%的孔底面积时，加入20μl处理液，37℃继续培养48h。使用mtt的方法检测活细胞的比率并计算存活率。

2结果

　 cd基因扩增产物大约为1.3kb，与genebank中记录的cd基因大小相同。uprt基因扩增产物大约为0.6kb，与genebank中记录的uprt基因大小相同。酶切后的ptrkh2pst质粒片断大约为6.9kb。重组的ptrkh2pst/cd约为8.2kb，重组的ptrkh2pst/uprt质粒为7.5kb。重组质粒ptrkh2pst/cd和ptrkh2pst/uprt用双酶切系统酶切后的小片断与同一个基因的pcr扩增产物大小相同，见图1、2。

质粒ptrkh2pst/cd和ptrkh2pst/uprt的测序结果表明cd基因的大小（1.3kb）和序列与genebank中公布的序列相同，uprt基因的大小(0.6kb)和序列与genebank中公布的序列相同。测序结果证明cd基因和uprt基因被正确的插入了ptrkh2pst质粒中。之后，重组质粒被成功的转化入双歧杆菌中。

重组质粒ptrkh2pst/cd和ptrkh2pst/uprt在婴儿双歧杆菌中的mrna水平表达结果，见图3、4。含ptrkh2pst /cd的双歧杆菌结果可见一条约1.3kb条带且无非特异性条带，见含ptrkh2pst /uprt的双歧杆菌结果可见一条约0.6kb条带，亦无非特异性条带，见图4。证明外源基因cd、uprt能够在婴儿双歧杆菌中正确地表达mrna。

提取带有ptrkh2pst/cd的阳性转化菌的全细胞蛋白，sds聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果可见一条大小约为52kda的条带，与cd蛋白质的大小相符，见图5，而对照组中无此条带，由此推测此条带为cd蛋白质。提取带有ptrkh2pst/uprt的阳性转化菌的上清液蛋白，sds聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果可见一条大小约为26kda的条带，与uprt蛋白质的大小相符，见图6，而对照组中无此条带，由此推测此条带为uprt蛋白质。

mtt实验结果表明，cd+uprt组细胞存活率低于对照组（p<0.01），cd组细胞存活率也低于对照组（p<0.05），但不如cd+uprt组明显。1: 200bp dna ladder marker;2: rtpcr product of rna purified from bifidobacterium infantis with ptrkh2pst/cd;3: positive control图3重组婴儿双歧杆菌中cd基因在mrna水平的表达

3讨论

　　肿瘤的自杀基因治疗已经发展了近20年，最初携带自杀基因的载体是病毒，而转染的对象为肿瘤细胞[78]。但是，当施行系统治疗时，低肿瘤靶向性、转化肿瘤细胞的低效率都限制了它的发展。因此，研究者们试图寻找有更高靶向性和更高杀伤肿瘤细胞自杀基因治疗系统。

以往的很多研究结果已经证明，在实体瘤中存在一些低氧的区域非常适合厌氧菌的存活[910]。恶性肿瘤中存在大量的无氧糖酵解，以及一个相对缺氧的区域，尤其是它的中心区域。vaupel等［11］研究了组织中的氧分压，发现在恶性实体瘤的中央区域氧分压低至2.5mmhg以下，远低于正常组织的24~66mmhg。实体瘤的这个特点可能会给厌氧菌在其低氧区定植提供良好的环境[34]。这给了我们新的启示，厌氧菌可能成为一个抗肿瘤治疗的良好靶向载体。cd/5fc系统是自杀基因的原型。全身给予5fc时，靶向到肿瘤局部的cd基因可以局部转化低毒的5fc为抗肿瘤药物5fu,从而杀死肿瘤细胞，同时对全身的毒性则大大降低，同时构建cd/5fc的协同杀伤机制将可能克服肿瘤对5fu产生的抗药性。5fu杀灭肿瘤细胞的机制包括被进一步代谢为5fdump、5fdutp和5futp，这些分子可以干扰细胞rna 和dna合成[1213]。uprt 是一种来源于原核生物的酶，它可以非常有效的催化5fu生成5fdump，使得5fdump、5fdutp和5futp大量增加，从而增强5fc/cd系统对肿瘤细胞的杀伤作用。所以构建cd 和uprt相结合的双自杀基因系统将可能显著增强该系统的肿瘤杀伤能力[1418]。

当厌氧菌被重组为携带有表达自杀基因的质粒时，厌氧菌的肿瘤靶向性将使得它们在肿瘤组织聚集，而原药5fc将在肿瘤组织内部被自杀基因cd/ uprt转化为细胞毒性的抗肿瘤药物。婴儿双歧杆菌是一种非致病性的厌氧菌株。本实验室在先前的研究中已经证明了其对实体瘤的靶向性[3]，并构建出携带有pgex1lamdat/cd和pgex1lamdat/uprt的婴儿双歧杆菌，并且表现出体外对肿瘤的杀伤作用，但由于pgex1lamdat是大肠杆菌表达载体，重组至厌氧菌中其蛋白质的表达效率并不令人满意[1819]。a:control;b.b16f10 cells treated by supernatant fluid of the bifidobaterium infantis transferred with the recombinant ptrkh2pst/uprt plasmid;c:b16f10 cells treated by supernatant fluid of the bifidobacterium infantis transferred with the recombined ptrkh2pst/cd plasmid;d:b16f10 cells treated by supernatant fluid of the mixture of bifidobacterium infantis transferred with the recombined plasmid ptrkh2pst/uprt and bifidobacterium infantis transferred with the recombined plasmid ptrkh2pst/cd

图8不同组婴儿双歧杆菌上清液处理后鼠黑色素瘤细胞b16f10的形态变化(×100)

fig 8the morphologic changes of melanoma b16f10 cells after different treatment(×100)ptrkh2pst质粒是在ptrkh2的基础上，加入乳酸短杆菌的启动子(p)、信号肽序列(s)及终止子序列( t)构建而成，可以在乳酸菌和双歧杆菌中高效率表达分泌型蛋白质[5]。结果表明，ptrkh2pst/cd和ptrkh2pst/uprt婴儿双歧杆菌分泌性自杀基因表达系统最终被成功构建，并已获得了cd，uprt基因mrna水平和蛋白质水平的良好表达。在体外杀伤鼠黑色素瘤细胞的实验中，当5fc浓度达到1μmol/ml时，双自杀基因表达系统组中黑色素瘤b16f10细胞的存活率非常低，该自杀基因表达系统表现出非常不错的抗肿瘤效果，但同时重组婴儿双歧杆菌的代谢出现了很大变化，这一点也体现在重组菌活力相对较低上。而该系统在鼠体内的抑瘤效果，以何种剂量，何种方式给药能达到最好的抑瘤效果，以及此系统的临床实用价值是我们将来所要解决的问题，有待我们进一步的实验探讨。

【参考文献】
［1］方煜翔，薛京伦，田聆.翻译起始的调控与肿瘤靶向基因治疗［j］.中国肿瘤生物治疗杂志，2008，15（4）：396400.

［2］钱其军，张琪.肿瘤靶向治疗的现状与展望［j］.中国肿瘤生物治疗杂志，2006，13（4）：239242.

［3］吴瑜，易成，王树人,等.婴儿双歧杆菌对小鼠黑色素瘤模型肿瘤组织的靶向性[j].四川大学学报（医学版）,2003,34(3):435438.

[4]kazuyuki yazawa,minoru fujimori,jun amano,et al.bifidobacterium longum as a delivery system for cancer gene therapy: selective localization and growth in hypoxic tumors [j].cancer gene ther,2000,7(2):269274.

[5]o'sullivan dj,klaenhammer tr.high and lowcopynumber lactococcus shuttle cloning vectors with features for clone screening [j].gene,1993,137(2):227231.

[6]alessandra argnani,rob j leer,nicole van luijk,et al.a convenient and reproducible method to genetically transform bacteria of the genus bifidobacterium[j].microbiology,1996,142(1):109114.

[7]pinedo hm,peters gfj.fluorouracil: biochemistry and pharmacology [j].j clin oncol,1988,6(10):16531644.

[8]breitman ml,clapoff s,rossant j,et al.genetic ablation: targeted expression of a toxin gene causes microphthalmia in transgenic mice [j].science,1987,238(4833):15631565.

[9]moulder je,rockwell s.hypoxic fractions of solid tumors: experimental techniques,methods of analysis,and survey of existing data [j].int j radiat oncol biol phys,1984,10(5):695 712

[10]vaupel pw,hockel m.oxygenation status of human tumors: a reappraisal using computerized po2 histography [m]//tumor oxygenation.new york: fischerverlag,stuttgart,1994.219232.

[11]vaupel pw.oxygenation of solid tumors in drug resistance in oncology [m]//teicher ba.new york: marcel dekker,1993.5385.

[12]palmiter rd,behringer rr,quaife cj,et al.cell lineage ablation in transgenic mice by cellspecific expression of a toxin gene[j].cell,1987,50(3):435443.

[13]van der wilt cl,pinedo hm,smid k,et al.effect of folinic acid on fluorouracil activity and expression of thymidine synthase[j].semin oncol,1992,19 (2 suppl 3):1625.

[14]tiraby m,cazaux c,baron m,et al.concomitant expression of e.coli cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase improves the cytotoxicity of 5fluorocytosine[j].fems microbiol lett,1998,167(1):4149.

[15]adachi y,tamiya t,ichikawa t,et al.experimental gene therapy for brain tumors using adenovirusmediated transfer of cytosine deaminase gene and uracil phosphoribosyltransferase gene with 5fluorocytosine[j].hum gene ther,2000,11(1):7789.

[16]koyama f,sawada h,hirao t,et al.combined suicide gene therapy for human colon cancer cells using adenovirusmediated transfer of escherichia coli cytosine deaminase gene and escherichia coli uracil phosphoribosyltransferase gene with 5fluorocytosine[j].cancer gene ther,2000,7(7):10151022.

[17]miyagi t,koshida k,hori o,et al.gene therapy for prostate cancer using the cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase suicide system[j].j gene med,2003,5(1):3037.

[18]安丽娜，李著华，岳扬，等.婴儿双歧杆菌介导的cd和uprt联合5fc基因疗法对黑色素瘤的体外治疗实验研究[j].四川大学学报（医学版）,2007,38(1):2730,63.

[19]易成，郭志英，黄英，等.婴儿双歧杆菌介导的cd/5fc自杀基因系统对黑色素瘤的抑瘤实验[j].四川大学学报（医学版），2005,36（2）：165168.

［编辑：贺文；校对：周永红］doi:10.3971/j.issn.10008578.2009.02.003

论文网首页\|会计论文\|管理论文\|计算机论文\|医药学\|经济学论文\|法学论文\|社会学论文\|文学论文\|教育论文\|理学论文\|工学论文\|艺术论文\|哲学论文\|文化论文\|外语论文\|论文格式

		用户注册设为首页
	您现在的位置：中国论文网 >> 医药学论文 >> 肿瘤论文 >> 正文	会员中心
药学论文医学论文临床医学论文护理论文口腔医学论文肿瘤论文妇产科学论文内科论文外科论文儿科论文医学期刊