【摘要】 ［目的］ 探讨borna病病毒（bdv）感染与人类淋巴瘤的关系。［方法］ 采用荧光定量套式逆转录酶聚合酶链式反应(fq-nrt-pcr)，检测了经病理学诊断的非霍奇金淋巴瘤（nhl）14例、霍奇金淋巴瘤（hd）6例及健康人20例的外周血单个核细胞（pbmc）中bdv p24基因片段。［结果］ 20例淋巴瘤患者与20例健康对照者的bdv p24基因片段检测均为阴性。［结论］淋巴瘤与bdv感染无明显相关性。
【关键词】 淋巴瘤
relationship between lymphoma and borna disease virus
yang ze-song, chen jian-bin, mu jun, et al.
(the first affiliated hospital, chongqing medical university, chongqing 400016, china)
abstract: ［purpose］ to explore the relationship between lymphoma and infection of borna disease virus (bdv). ［methods］ the p24 fragment of bdv rna in peripheral blood mononuclear cells (pbmc) in 14 cases with pathologically proved non-hodgkin lymphoma（nhl）, 6 cases with pathologically proved hodgkin lymphoma （hd） and 20 volunteers was examined by fluorescence quantitative nested reverse transcriptase polymerase chain reaction (fq-nrt-pcr). ［result］ the bdv p24 fragment was not found in 20 patients with lymphoma and 20 volunteers. ［conclusion］ the infection of bdv may be not correlated to lymphoma.
key words: lymphoma; borna disease virus（bdv）; polymerase chain reaction (pcr)
borna病病毒（borna disease virus，bdv）是一种高度嗜神经性的rna病毒，能引起马的致死性脑炎即borna病（borna disease，bd）[1]。Www.11665.Com有研究提示，bdv可能与人类肿瘤发生有关。近年来有报道bdv磷蛋白p24能直接与一种多功能蛋白amphterin（hmgb1）的a-box结构域结合，这一结构域与肿瘤抑制因子p53有交互作用，并证明bdv磷蛋白p可能是与hmgb1结合而抑制p53的一种特殊抑制因子，这可能是bdv感染诱发肿瘤的机制之一[2]。我们采用荧光定量套式rt-pcr（fluorescence quantitative nested rt-pcr，fq-nrt-pcr）检测临床经病理诊断的淋巴瘤患者外周血单个核细胞（pbmc）中bdv p24基因片段。现将初步结果报道如下。
1 材料与方法
1．1 研究对象
20例病例均系我院血液内科2004年1月至2005年6月经病理学确诊的淋巴瘤初诊住院患者，其中非霍奇金淋巴瘤（nhl）14例(男性9例，女性5例，平均年龄30.3±12.4岁，b细胞淋巴瘤4例，t细胞淋巴瘤10例)，霍奇金淋巴瘤（hd）6例(男性4例，女性2例, 平均年龄26.1±7.5岁，淋巴细胞为主型2例，淋巴细胞衰减型3例，混合细胞型2例)。以上患者临床分期均为ⅳb期。20例患者均出现不同程度的发热、盗汗和体重减轻，均无肿瘤及肿瘤家族史。来自农村的患者11例，来自城市者9例。7例患者有长期（3～15年，平均9.5±3.3年）动物密切接触史，但均否认与患病动物或病死动物接触史，其中养猫者2例，养狗者3例，养牛者1例，养羊者1例；有较长期野外工作史（从事地质勘探工作3～5年）者2例；有较长接触苯等装修材料者2例；其余患者均无密切接触动物史和长期野外工作史及接触苯等装修材料史。健康对照男女各10例，平均年龄29.3±9.2岁。
1．2 主要试剂及仪器
引物序列由上海博亚生物技术有限公司合成；荧光探针的序列由中山大学达安基因诊断中心合成。roter-gene3000荧光定量pcr仪（澳大利亚corbett research公司），四甲基罗达明（tramethylrhodamine，tamra），pe394探针合成仪（美国perkin elmer公司），淋巴细胞分离ficoll-conray液（上海恒信化学试剂有限公司），tripure rna提取试剂盒（boehring-mannheim公司）等。
1．3 实验方法
1．3．1 引物和探针设计、合成
从美国国立卫生研究院基因列数据库（genebank）中调出bdv的第二开放阅读框（orfⅱ）区序列，设计扩增bdvp24基因片段的引物序列为：①外引物：p1：5′-tcagacccagaccagcgaa-3′(19bp)；p2：5′-atctggggataaatgcgcg-3′(19bp)。②内引物：p1：5′-ccctccaagtggaaaccat-3′(19bp)；p2：5′-cagtatcttgatgttctcgcca-3′(22bp)。设计荧光定量pcr bdvp24基因片段探针序列为：5′-（fam）tcagcggtgcgaccaccactccgatagc（tamra）-3′（25bp），其中5′标记的荧光发光基团为tamra。探针纯化采用15%聚丙烯凝胶电泳后分割胶分离纯化，纯化后的探针测定其od值，计算其含量，置-20℃备用。
1．3．2 提取细胞rna
本实验凡涉及rt-pcr实验的所有用品均严格按消除rnase的常规方法处理。每例实验对象均采外周血10ml，用ficoll-conray液分离pbmc，采用tripure rna提取试剂盒提取细胞总rna，标本置-20℃保存[3]。随机取3份提取的pbmcs总rna，1%琼脂糖凝胶电泳后判断其纯度。取5μl提取的pbmcsrna稀释100倍，用紫外分光光度计测定od值，并计算其浓度。
1．3．3 bdvp24阳性定量标准曲线的建立
取10μl已纯化的阳性重组质粒[3]，稀释50倍，紫外分光光度仪上测定其od值，计算其浓度。分别用10mm tris-cl稀释成107、106、105、104、103拷贝数/μl浓度梯度，加5μl于不同反应管中在roter-gene3000荧光定量pcr仪上进行扩增[3]。所有反应信息资料被roter-gene3000荧光定量pcr仪收集并储存，反应结束后根据阳性定量标准模板的扩增情况自动绘制出标准曲线。
1．3．4 fq-nrt-pcr
进行常规套式nrt-pcr[3]时，在第二轮扩增amplification的反应混合物（reaction mixture）中加入荧光标记探针进行荧光定量pcr，扩增bdv orfⅱ基因目的片段为86bp。进行逆转录反应，在含样本rna的反应管中加入逆转录体系9μl，外引物一对各0.5μl，逆转录酶mmlv 20u，总反应体积11μl，37℃ 60 min，95℃ 3min。取逆转录后反应液10μl，加外引物一对各1μl，进行第一轮pcr；第二轮pcr总反应体积50μl，含第一轮扩增产物5μl，10mm dntp 1μl，taq酶3u，25mm mgcl2 10μl，内引物一对各1μl，荧光标记探针1μl。每份标本同时检测β-actin作内参照。每次实验设阴性对照。
1．3．5 bdv p24基因cdna片段的克隆及测序
阳性pcr产物用醋酸钠、乙醇沉淀法纯化后与t载体连接，转化大肠杆菌，采用蓝白斑及菌落—fq-pcr鉴定筛选重组子，每一标本同时收集3个阳性菌落培养。集菌提取质粒dna，再用fq-pcr进行鉴定，阳性质粒重组子送上海生物工程有限公司测序。
1．4 统计学方法
采用sas软件进行fisher精确概率检验。
2 结 果
2.1 pbmcs总rna的提取质量和纯度
4份样本电泳后可见28s、18s两条清晰的条带和稍欠清晰的5s条带，说明提取的rna样品纯度较高，完整性较好，无dna污染，无降解。并测定其od值，od260/od280分别为1.795、1.846、1.733，均在1.7以上，说明提取的rna样品纯度较高，计算rna浓度分别为0.524、0.872、0.416μg/μl。rna的提取质量达到pcr要求。
2.2 标准阳性曲线的建立
阳性模板共5个梯度，扩增后均呈典型的s形曲线，阴性对照无荧光量改变，取其中3个变异程度最小的梯度制定阳性标准曲线；起始模板数与循环阈值（ct值）之间有良好的线性关系，相关系数r=0.999。
2.3 标准曲线中阳性质粒扩增与测序
阳性模板中提取质粒dna，再用fq-pcr进行鉴定，阳性质粒重组子送上海生物工程有限公司测序,测序结果均为5′ccctccaagtggaaaccatcc-
agacagctcagcggtgcgaccactccgacagcat-caggattcttggcgagaacatcaagatactg3′。登陆美国国家生物技术信息中心(ncbi)，并用blast 软件对genebank数据库进行相应目的序列（86bp）的同源性检索和比对。结果证实所扩增片段系bdv p24 基因片段，与人类基因组片段和其他病毒基因组片段无同源性，确定扩增成功。
2.4 淋巴瘤患者及健康人bdv p24基因片段的检测
每次5个梯度对照的阳性模板均扩增成功, 扩增曲线呈s形，阴性对照无荧光量改变，选取变异程度最小的3个阳性模板建立标准曲线，其相关系数均在0.99以上，接近1，说明ct值和定量浓度对数值两者之间相关性好，定量较准确。20例淋巴瘤患者与20例健康对照组样本检测bdv p24基因片段曲线部分为一直线，部分有少许荧光改变，但均在阈值线下方，说明淋巴瘤患者和健康人bdv p24基因片段均为阴性。
3 讨 论
恶性肿瘤的发生是多因素多阶段作用的结果，肿瘤发病机制中病毒学说已受到越来越多的关注。病毒感染可引起多种肿瘤发生[4]，有研究[5]提出eb病毒与血管免疫母细胞的淋巴瘤有密切关系，并提出了相应的病原学证据；羊痘病毒和牛丘疹口炎病毒感染可诱发人类良性上皮瘤和组织细胞瘤；人类间皮瘤和脑肿瘤中存在猴病毒sv40感染[6]；动物乳头瘤病毒-7感染可致屠夫手疣，并有研究利用乳头瘤病毒属来制造抗肿瘤疫苗[7]。
直到近年来才证明部分淋巴瘤确为病毒感染所引起[8]。人类淋巴瘤最早证实的是burkitt淋巴瘤与eb病毒感染有关，认为该病是非洲儿童在婴幼儿期重度和持续eb病毒感染，免疫功能受到抑制，癌基因被激活，导致b淋巴细胞恶性增殖的后果[9]。早在1987年gallo等从1例蕈样霉菌病肿瘤组织中分离到c型rna病毒，称之为t细胞白血病淋巴瘤病毒（htlv-1）。至今已有近十名t细胞淋巴瘤患者的肿瘤标本中分离到这种病毒，认为是一种高度特异性的病毒[10]。
国外肿瘤与病毒关系的科学领域内，一种新近逐渐被人们认识的特异嗜神经病毒-bdv正被引起广泛注意。已有研究[2]发现hmgb1和p53能加强p53介导的转录活动。哺乳类双杂交分析显示p53和bdv磷蛋白p能竞争性干扰p53缺陷细胞系（nci-h1299）中每种蛋白与hmgb1的结合。除此之外，bdv磷蛋白p能明显减少p53介导的细胞周期蛋白g增强子的转录激活作用。而且，p21（waf1）的表达激活在环孢菌素处理的bdv感染细胞和p53转导的nci-h1299细胞中被抑制。许多研究者在进行bdv分子特征研究时，已经成功建立了bdv的持续感染模型，而大鼠的星形细胞瘤系是常用细胞模型[11]。
本研究运用fq-nrt-pcr检测淋巴瘤患者pbmc中bdv p24基因片段，在20例淋巴瘤患者中其bdv p24基因片段检测均为阴性，20例健康献血者中均未检出。本实验不支持bdv与淋巴瘤的发生具有相关性。虽本实验所采用方法fq-nrt-pcr的特异性和敏感性均较一般的rt-pcr方法高，但因本实验中样本量相对较少，有待增加样本量进一步研究。
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