摘要】 目的 研究甲基化结合蛋白mecp2对肺癌细胞a549增殖的影响。方法 针对genebank中mecp2基因的不同靶点，设计并合成两条dna干扰序列，克隆到真核表达载体psilencer2.1u6，构建能够转录形成mecp2shrna的重组质粒psilencermecp2，经pcr、测序鉴定正确后，稳定转染a549细胞，在mrna和蛋白水平观察两重组质粒对mecp2的干扰作用，mtt法检测对细胞增殖能力的影响。结果 成功构建两个针对mecp2不同靶序列的shrna真核表达质粒，两质粒在mrna和蛋白水平可以使mecp2表达明显下调，稳定转染两质粒的a549细胞增殖能力明显减弱。结论 甲基化结合蛋白mecp2参与了肺癌细胞的恶性增殖。
【关键词】 rna干扰；mecp2;肺癌
effects of inhibition of methylcpginding protein 2 by rna interference on proliferation of lung carcinoma cell a549
qiu xiaohua1,guo lingling2, duan fengying3, wang hanjiao4
1. department of molecular medicine laboratory, the second affiliate hospital of nanchang university, nanchang 330006, china； 2. department of respiration, the people's hospital of jiangxi province, 3. department of respiration, the second affiliated hospital of nanchang university, 4. department of oncologyabstract：objective to study the effects of mecp2 in proliferation of lung cancer cell lines a549.methods by the sequence of human mecp2 gene in genebank, the oligonucleotides encoding shrna targeting the mecp2 gene were designed and sythesized， then directionally cloned into plasimd psliencer2.1u6, confirmed by pcr and dna sequencing analysis， the recombinant plasimd was transfected into a549 cell line by lipofectamine tm2000. the expression of mecp2 at mrna and protein was examined by rtpcr and western blot respectively, the changes of cell proliferation were observed by mtt assay. results the two shrnas expressing plasmids targeting the mecp2 gene were constructed and transfected into a549 cell line successfully. the expression of mecp2 in mrna and protein levels was reduced visibly. the down regulation of mecp2 inhibited the proliferation of a549 cell significantly. conclusion the mecp2 protein plays an important role in the proliferation of lung cancer cell.
key words：rna inference; mecp2; lung cancer
dna甲基化可使抑癌基因转录失活，从而导致肿瘤的发生[1]，在此过程中，甲基化结合蛋白mecp2 （methylcpgbinding protein 2）起着关键作用［2］。wWW.11665.coMrna干扰是近年来发展起来的一项基因阻断技术，利用小片断双链rna（double strands rna，dsrna）进行转录后基因沉默，能够迅速降解靶基因［3］。本课题为了研究mecp2蛋白在肺癌细胞恶性增殖中的作用，针对mecp2基因不同靶点，重组构建了能够转录形成发夹状mecp2shrna的真核表达质粒psilencermecp2，然后稳定转染肺癌细胞a549。观察mecp2表达的降低对肺癌细胞a549恶性增殖生物学特性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
psilencer2.1u6线性化的质粒购于美国ambion 公司；mecp2shrna的转录模版由上海生工合成；t4dna连接酶、rtpcr试剂盒、质粒去内毒素小提取试剂盒购于美国promga公司；jm109感受态大肠杆菌购于博达泰克公司；a549细胞为南昌大学二附院医学分子重点实验室保存；脂质体2000购于invitrogen 公司；mecp2一抗（兔抗人多克隆）购于satau cruz公司。
1.2 方法
1.2.1 mecp2shrna转录模版dna的设计
根据shrna的设计原则,针对mecp2的mrna序列(nm00492,bc011612)，利用abmion设计软件选取mrna的487～507、793～813两段序列为干扰靶序列，并引入bamhⅰ和hind ⅲ酶切位点。设计序列结构为：bamhⅰ+sense+loop+antisense+tttttt终止信号+hindⅲ,序列如下：
5′gatccgctccttgtcaagatgcctttca
agagaaggcatcttgacaaggagctttttt
ggaaa3′
3′gcgaggaacagttctacggaaagttc
tcttccgtagaactgttcctcgaaaaaacc
ttttcga5′
5′gatccgtggagttgattgcgtactttca
agagaagtacgcaatcaactccactttttt
ggaaa3′
3′gcacctcaactaacgcatgaaagttc
tcttcatgcgttagttgaggtgaaaaaacc
ttttcga5′
1.2.2 真核表达质粒的构建
将合成的单链按说明书退火成双链，用t4dna连接酶连接到线性化psilencer2.1u6载体上，转化感受态大肠杆菌jm109。涂于含氨苄青霉素的lb平板上，挑取单克隆摇菌过夜，提取质粒鉴定。
1.2.3 真核表达质粒的鉴定
以所提质粒为模版，pcr鉴定（引物序列p1: 5′taatacgactcactataggg; p2: 5′ag
gcgattaagttgggta），pcr产物用1％琼脂糖进行电泳。将初步鉴定构建成功的质粒送上海生工测序，测序正确的两质粒分别命名为psilencermecp21和psilencermecp22。
1.2.4 细胞培养及转染
人肺癌细胞系a549培养于含10%胎牛血清的dmem培养液中，待细胞生长状态良好接种至6孔细胞培养板中。随机分组：空白组（a549经pbs溶液处理）；阴性对照组（转染阴性质粒）；实验1组（转染psilencermecp21质粒）；实验2组（转染psilencermecp22质粒），待各组细胞密度达80％～90％时按脂质体说明书进行转染。
1.2.5 单克隆的挑取
转染后48h加潮霉素筛选，潮霉素浓度为125μg/ml（由细胞浓度梯度实验确定）。待正常组细胞几乎全部死亡时，将实验组细胞采用有限稀释法稀挑取细胞单克隆。
1.2.6 重组质粒对mecp2干扰作用
（1）rtpcr检测mecp2 mrna表达 引物序列为：p1:cagaagaccaggacctcc p2:aatacacatcatacttcccagc；βactin引物序列为:p1:aggggccggactcctcatact p2:acactgtgcccatctacgacg，采用trizol提取转染筛选后细胞rna,rtpcr按试剂盒说明书进行，同时扩增βactin为内参，1.2%琼脂糖进行电泳。
（2）western bolt检测mecp2蛋白表达 提取各组总蛋白，bradford的方法测定蛋白的含量，取适量样品，进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；电转到pvdf膜上用含5％脱脂奶粉4 ℃封闭6h；加入1∶1 000兔抗人(mecp2)多克隆抗体，4℃下孵育过夜；再用1∶5 000山羊抗兔igg二抗孵育4h。化学发光法分别检测pvdf膜上mecp2蛋白的表达量。
1.2.7 mtt检测细胞增殖
将各实验组处对数生长期的细胞接种于96孔板,接种密度为1.5×105/ml每孔体积200μl,每组细胞接种于6个孔中。第7孔加等体积的培养液作为空白对照。37℃孵育过夜后,每孔加入20μl mtt,继续孵育4h,终止培养。然后吸出孔内培养上清液,加入150μl二甲基亚砜(dmso),振荡10min,在酶联免疫检测仪上于490nm波长处检测不同时间点各标本的吸光度(od值),绘制细胞生长曲线。
1.3 统计学方法
采用统计软件spss13.0分析，实验数据均以±s表示。四组间数据采用完全随机单因素方差分析，两两比较采用t检验。取p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 重组质粒的构建和鉴定
依据psilencer2.1u6推荐的测序引物，插入64 个碱基后，阳性克隆的基因片段为560bp。重组质粒经pcr初步鉴定有5个能扩增出560bp大小的明亮条带，见图1, dna测序后，其中两个质粒构建完全正确，见图2，分别命名为psilencermecp21和psilencermecp22。
2.2 稳定转染a549细胞单克隆鉴定
1、2、3： psilencer2.1u6shrna1；
4、5：psilencer2.1u6shrna2; 6： marker
图1 重组质粒的pcr鉴定图
fig 1 identification of recombinant vector by pcr图3 细胞单克隆图
fig 3 cell colony
质粒稳定转染人肺腺癌细胞a549,采用有限稀释法挑取细胞单克隆，见图3。
2.3 重组质粒对mecp2 mrna干扰检测
转染后各组细胞的rtpcr结果，见图4。
spss13.0统计结果表明：实验1组和实验2组与空白组相比差异有统计学意义（p<0.05），两质粒在mecp2 mrna水平干扰效果分别达到53.8%和58.5%。
2.4 重组质粒对mecp2蛋白干扰的检测
转染后各组细胞mecp2蛋白水平的检测结果，见图5。
spss13.0统计结果表明：与空白组和阴性组比较，实验1组和实验2组光密度值均下降，差异有统计学意义（p<0.05）, psilencermecp22和psilencermecp22质粒在蛋白水平干扰效果分别为15%和40%。
2.5 mtt检测细胞增殖情况
以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞增殖曲线，见图6。
spss13.0分析表明：在第1天和第2天各组细
1:marker(100bp、250bp、500bp、750bp、1 000bp、2 000bp)；2:normal a549;3:negative control;4:psilencermecp21；5:psilencermecp22
图4 mecp2mrna表达检测图
fig 4 the expression of mecp2 in the lung
cancer cells a549 detected by rtpcr
a:psilencermecp21；b:psilencermecp22
图2 质粒测序图
fig 2 sequence analysis
1: normal a549; 2: negative control; 3:psilencermecp21;
4:psilencermecp22
图5 mecp2蛋白光密度测定结果
fig 5 mecp2 expression in the lung cancer
cells a549 detected by western blot
图6 细胞增殖曲线图
fig 6 the proliferation of a549 cell by rnai 表1 rnai对细胞增殖的影响胞增殖速度无明显差别；从第3天开始实验1组和实验2组细胞增殖速度与空白组相比明显减慢，但与阴性组相比无明显差别，且实验1组和实验2组增殖速度差异不明显；从第4天开始，实验2组增殖速度明显慢于实验1组；在第6天，4个组增殖速度出现明显差异，空白组>阴性组>实验1组>实验2组。
3 讨论
本研究构建针对甲基化结合蛋白mecp2的真核表达质粒，稳定转染人肺腺癌细胞a549,发现mecp2表达的下调可以使肺腺癌细胞a549增殖能力明显减弱，尤其是psilencermecp22质粒组（实验2组）对a549细胞增殖能力减弱更明显。这可能与psilencermecp22质粒对mecp2的干扰作用更强有关，mecp2蛋白表达的下调降低了其阅读和传递甲基化信息的桥梁作用，尤其是在某些mecp2参与的抑癌基因如rassfla的失活过程中[4]，从而一定程度使原本因高甲基化而转录失活的抑癌基因发生再表达，继而抑制了肿瘤细胞的恶性增殖。另一种可能是mecp2蛋白也参与了许多调控肿瘤生长的信号通路，该蛋白的存在可以使某些与肿瘤生长相关的蛋白因子维持一定的高水平，从而刺激肿瘤细胞的生长，如bernard d等[5]发现的mecp2可以通过维持一定水平的cmyc原癌蛋白而维持前列腺癌细胞的生长。但在肺癌细胞中该蛋白维持细胞恶性增殖能力是否通过该机制还需深入研究。
总之，本研究成功构建的两个针对甲基化结合蛋白mecp2的shrna真核表达质粒，并稳定转染了人肺癌细胞a549，初步证明该蛋白参与了肺癌细胞的恶性增殖，从而为下一步研究该蛋白的功能及表观遗传学机制奠定了良好的基础。
【参考文献】
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[3] filipowicz w,jaskiewicz l,kolb fa,et al. posttranscriptional gene silencing by sirna and mrnas[j]. curr opin struct biol,2005,15(3):331341.
[4] klose rj, sarraf sa, schmiedeberg l, et al. dna binding selectivity of mecp2 due to a requirement for a/t sequences adjacent to methylcpg[j]. mol cell,2005,19(5):667678.
