【摘要】 目的 探讨食管鳞癌（escc）患者癌组织基因表达谱。 方法 取3例无escc家族史的癌及癌旁组织等量混合，抽提rna,将rna逆转录合成相应cdna，以cy5和cy3标记cdna作为探针,在含有14 000点人类基因组芯片(biostarh140s)上进行杂交。用scanarray 4000扫描仪扫描芯片荧光信号图像,用genepix pro 3.0软件对扫描图像进行数字化处理和分析。结果 依ratio(cy5/cy3)>2.0或<0.5的数据项为差异表达的基因共1 855个。含表达序列标签(est)844个，下调基因378个，上调基因466个。在1 011个已知功能的基因中，下调基因560个，上调基因451个。包含各类功能基因。同时与6例具有家族史escc组织差异基因进行了初步分析。经与ncbi基因库比对，有8个基因相同，且异常表达这与报道相符。 结论 基因芯片是一高效筛选食管癌相关基因的方法。在escc的发生、发展中存在着大量异常表达基因。
【关键词】 食管鳞癌（escc）;基因表达谱；基因芯片
screening gene expression profiles of both esophageal squamous cell carcinoma tissues and adjacent almost normal tissues by microarray
jiang yuzhang1, xiong huashen2，guo wei2, sun suan3
1．department of medical laboratory, the affiliated huai' an first hospital of nanjing medical university, huai' an 223300，china, 2．department of cardiothoracic surgery, 3．department of pathologyabstract：objective to investigate the difference of gene expression profile in esophageal squamous cell carcinoma tissues (escc) and their adjacent almost normal tissues. methods the cdna retro–transcribed from 3 cases mrna，which consisted of equal quantity of both escc and adjacent almost normal tissues，was labeled with cy5 and cy3 fluorescence as a probes. the mixed probes were hybridized with a piece of biostar h140s single dot human whole gene chip. the fluorescent signal was scanned by scanarray 4 000 instrument. the acquired image was analyzed by genepix pro 3.0 software. results in 1 855 genes,whose cy5/cy3 ratios were greater than 2 or less than 0.5. there were 844 expressed sequence tags(ests), including 378 downregulated genes and 466 upregulated genes.on the other hand, among the 1 011 genes, which were acquired from genebank, included 560 downregulated genes and 451 upregulated genes.in the meantime,compared with the profiles from 6 cases of escc with family history,there were 8 of the 1 011 genes identical to the genebank,and the expression of the 8 genes were same as the report as well. conclusion using the microarray to detect the difference of gene expression profiles might be of benefit to rapid select the relative genes of the esophageal carcinoma. there are lots of genes involved in the progression of escc.
key words：esophageal squamous cell carcinoma；gene expression profiles; microarray
食管癌是严重影响人们生活质量的重要因素之一。wWw.11665.cOM江苏省淮安市是我国食管癌高发区之一，且其中绝大多数为鳞癌。因此从分子生物学水平来研究揭示食管鳞癌（escc）的发病机制具有重要价值。近几年应用基因芯片对肿瘤组织基因表达谱的研究偶有报道[12]。为此，我们运用上海联合基因公司的14 000点人类基因组芯片(biostarh140s) 来研究escc基因表达谱,寻找在escc及癌旁组织中的差异表达基因。
1 资料与方法
1.1 研究对象 3例无escc家族史且无淋巴结转移的癌及相应癌旁组织，术前患者均未接受过放疗或化疗，病理诊断癌组织为中分化到高分化鳞癌,癌旁组织为正常鳞状上皮,并排除癌细胞浸润。
1.2 取材及组织处理 见文献［1］。
1.3 基因芯片制备 见文献［1］。
1.4 总rna提取、预杂交、标记探针、杂交、鉴定 见文献［1］。
2 结果
2.1 3例无家族史且无淋巴结转移的escc患者的癌及癌旁组织基因表达谱
依荧光素cy5/cy3比值 (ratio)>2.0或<0.5的数据项差异表达，在14 112个基因中共筛选出1 855个差异表达基因，占总数的13.1%（1 855/14 112）。在异常表达的基因中，表达序列标签(est)844个，其中下调基因378个，上调基因466个。在1 011个已知功能的基因中，下调基因560个，上调基因451个。
2.2 escc患者癌及癌旁组织不同功能差异基因表达谱
为了便于比较，另将6例有escc家族史患者癌及癌旁组织差异表达基因列出，见表1。
2.3 基因表达谱结果比对
为了分析escc差异基因表达谱的研究近况，我们查询了近期在美国国立生物技术信息（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）基因库中登记的与食管癌相关的244个基因，并利用office 2003的access进行比对，结果本研究筛选出1 011个非est基因中，共有8个基因与基因库中基因相同，见表2。
2.4 芯片结果反证
为了验证芯片结果的有效性，我们以3例escc组织和食管癌细胞株（eca109）为研究对象，进行rtpcr试验，验证ube2c基因产物。上游引物：tgatgtctggcgataaaggga；上游引物：agcgagagcttatacctcagg。pcr反应条件：94℃预变性5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，35个循环；72℃ 延伸10min,符合预期结果。
3 讨论
食管癌在我国呈现地域性高发的分布特点，研究不同高发地区escc基因表达谱，对进一步探索escc差异表达基因，具有重要意义。另考虑到肿表1 有和无escc家族史患者癌及癌旁组织不同功能差异基因表达谱瘤具异质性，本课题将有3例escc家族史癌及癌旁组织等量分别混合抽提总rna，进行基因芯片检测分析，初步寻找共同的差异表达基因。
在escc中上皮膜蛋白1（emp1）基因下调。jain a等[3]研究认为emp1作为gefitinib(易瑞沙)的临床治疗肿瘤的抗性标志分子, 是一种表皮生长因子受体(egfr)的atp结合位点抑制剂。另wang等[4] 报道人类emp1 基因的过表达可抑制ec9706细胞株的s期增殖和延长g1期。
在escc中也低表达。guo等[5]采用病例一对照分子流行病学方法，分析cyp2 e1、adh1b和aldh2三者单核苷酸多态性（snp），结果认为甘肃省乙醇的消费量和 cyp2 e1、adh1b和aldh2基因多态性是 escc的重要危险因子, 而且cyp2e1、aldh2和adh1b三者的snp与和高饮酒量协同致癌。说明环境和饮食因素在escc的发生、发展中也有重要的作用。
另在escc中jwa基因表达下调。tang等[6]多聚酶链反应单链构象多态性（pcrsscp）检测 jwa外显子上游76g > c和在jwa基因第3外显子存在723t > g snp。分析413例胃癌和250例escc患者及814例正常的中国居民的两snp，报告基因分析方法显示，与-76g等位基因缺失相比， -76c变异体等位基因缺失与环境中苯并(a)芘暴露有关。且-76c等位基因缺失与胃癌和escc相关。另li 等[7]报道-76c、 454a和723g的snp与膀胱癌相关。
同样细胞周期蛋白g2基因（ccng2)在escc中低表达。体内和体外试验证实，利用抗her2单抗曲妥珠单抗（trastuzumab）或其前体（4d5）治疗经实时荧光定多聚酶联反应检测过度表达（bt474、skbr3 和 mdamb453)的ccng2mrna高表达的乳癌细胞。针对ccng2的特异性抗体的免疫斑点和免疫荧光试验显示ccng2的特异性抗体可显著刺激ccng2的表达及由细胞质易位到细胞核。强化乳癌细胞株（t47d、mdamb435）表达her2引起ccng2表达下降。因此，上述结果提示her2介导的信号对ccng2起负调节作用。抑制磷酸肌醇3激酶（ly294002）、cjun氨基末端激酶（sp600125）、mtor)/p70s6激酶（p70s6k）的活性可促进ccng2的表达。相反， 抑制p38丝裂原活化蛋白激酶（sb203580）、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶激酶1/2(u0126)和磷脂酶c(u73122）不影响ccng2的表达。抗her2抗体与ly294002、雷帕霉素或sp600125结合治疗均比任何单一抗体刺激ccng2表达水平高。ccng2的异位表达抑制了周期素依赖的激酶2活性、rb磷酸化、细胞循环的进展及细胞增殖，但不影响p27(kip1)的表达。因此, 通过多途径包括磷酸肌醇3激酶、cjun氨基末端激酶和mtor信号介导, ccng2表达由her2 信号调节，但不影响p27(kip1)的水平。ccng2 对细胞循环和细胞增殖的负调节，将有助于抑制乳癌细胞生长[8]。
抗氧化酶(prdxs) 是哺乳动物细胞中抗氧化物酶家族成员之一。hoshino等[9]运用免疫组织化学方法研究prdx1在escc组织的表达水平及阐明 prdx1表达和临床状态之间的相互关系。研究114 例escc外科手术标本的prdx1免疫组织化学染色，以细胞prdx1 染色程度评分:1级：阴性或弱阳性; 2 级：中等阳性；3 级：强阳性。结果1级患者占20%(23 114)； 2级为44%(50/114); 3级占36%（41/114)。prdx1的免疫反应性与肿瘤的分级、淋巴结转移和肿瘤分期明显成负相关，且与高表达prdx1患者相比，prdx1低表达患者生存期明显短。prdx1表达状况可作为预测escc组织的一个很好的指标。本研究结果与报导相符。
但n肉豆蔻酰基转移酶2(nmyristoyltransferase 2, nmt2)在escc中高表达。bergqvist等[10]研究调控端粒酶活性的相关基因表达谱。运用端粒酶活性试验(trapeze 美国affymetrics 公司供，通过含14 500个人基因的u1332.0芯片表达谱)研究10株主要为p53突变的kyse系列人类食管癌细胞株（kyse 30、 70、 140、 150、 180、 270、 410、 450、 510和520）中端粒酶的活性。结果端粒酶的活性在所有细胞株中都检测到，且呈宽度分布，表达活性与恶性度成正相关（r>0.90）,同时，观察到下列基因与端粒酶的活性明显正相关: nmt2; ribosomal protein l3; retinoblastomalike 2(prb2/p130)和cyclin g2。仅zinc finger protein 207（锌指蛋白质 207）活性与端粒酶的活性成负相关。这些原始确认基因为研究食管癌相关端粒酶的基因谱提供了重要的候选基因。
wnt7b基因在escc中高表达。磷脂酰肌醇（glypicans）是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族之一。磷脂酰肌醇可调节各种不同细胞因子，包括 wnts、豪猪和骨形成蛋白质。capurro等[11]研究证实 gpc3 通过刺激wnt 信号传导，促进肝癌(hccs) 生长。而突变的gpc3不能被转化酶处理，但其在wnt激活和hcc生长中发挥了刺激作用。
ube2c在escc中高表达。ieta等[12]运用实时荧光定量多聚酶链反应(rtpcr)检测ube2c基因的表达状态，结合临床病理资料来研究65例hcc样品。结果，与非癌性的肝细胞相比，在hcc细胞中有很多基因上调，含ube2c基因，且65例中ube2c基因有62阳性。同时高ube2c基因表达还与肿瘤侵涉性、门静脉的侵涉性和肿瘤去分化程度相关(p<0.05)。与ube2c基因低表达的患者相比，ube2c基因高表达者生存期明显缩短。运用多变量的统计分析，ube2c是一独立的生存期评估因素。lin等[13]应用基因芯片检测barrett's食管组织，结果15例食管腺癌中11例有ube2c表达。组织芯片检测在10例发育不良食管组织和67例食管腺癌组织中，分别有70%(7/10) 和 87%(58/67)组织高表达ube2c。泛素结合蛋白酶（mg262）可使9株食管癌细胞株（h80t、l20t、ba1、oe33、seg1、bic1和 flo1细胞株均来自食管腺癌细胞，而s95b 为barrett's食管细胞经e6/e7逆转录病毒转染而成的细胞株，het1a为escc细胞株sv40转染而成）的ube2c基因沉默，从而抑制食管腺癌生长。
【参考文献】
［1］ 姜玉章，熊化生，郭伟，等. 食管鳞癌家族史患者癌及癌旁组织基因表达谱的初步研究[j].放射免疫杂志,2007,20（3）：282284.
[2] 卢晓梅，张月明，林仁勇,等.哈萨克族食管癌差异表达基因的研究[j].肿瘤防治研究,2005,32(2):7981.
[3] jain a, tindell ca, laux i,et al.epithelial membrane protein1 is a biomarker of gefitinib resistance[j]. proc natl acad sci u s a, 2005, 102(33):1185811863.
[4] wang ht, kong jp, ding f，et al.analysis of gene expression profile induced by emp1 in esophageal cancer cells using cdna microarray[j]. world j gastroenterol, 2003, 9(3):392398.
[5] guo ym, wang q, liu yz,et al.genetic polymorphisms in cytochrome p4502e1, alcohol and aldehyde dehydrogenases and the risk of esophageal squamous cell carcinoma in gansu chinese males[j]. world j gastroenterol, 2008,14(9): 14441449.
[6] tang wy, wang l, li c, et al.identification and functional characterization of jwa polymorphisms and their association with risk of gastric cancer and esophageal squamous cell carcinoma in a chinese population[j]. toxicol environ health part a,2007,70(11): 885894.
