【摘要】 目的 研究半边旗提取物5f对非小细胞肺癌ncih460细胞生长的抑制作用。方法 mtt法检测5f对ncih460细胞的生长抑制作用；用pihoechst荧光双染法和tunel法检测细胞凋亡；流式细胞仪检测5f对dna含量的影响。结果 5f抑制ncih460细胞的生长，其效果与5f的浓度和作用时间相关，24、48、72h的ic５０分别为：21.40、4.52、1.02μg/ml；荧光双染色法显示经5f作用后细胞出现变形，染色质浓缩，产生凋亡小体；细胞被阻滞在g2/m期。结论 5f在体外能有效地抑制ncih460细胞的生长，其作用可能是通过诱导其凋亡产生的。
【关键词】 半边旗； 5f； ncih460； 生长抑制
inhibitory effects of 5f from pteris semiinnata l. on proliferation of nonsmall cell lung cancer ncih460 cells
liu yi1，wu kefeng1，li li1，george g chen2，michael ky hsin2，malcolm j underwood2，liang lianci1，3
1. guangdong key laboratory for research and development of nature drugs，guangdong medical college， zhanjiang 524023，china；2. department of surgery，the chinese university of hongkong，prince of wales hospital，shatin，n.t.；3.institute of biochemistry and molecular biology，guangdong medical college
corresponding authors：liang lianci，email：[email protected]：objective to investigate inhibitory effects of 5f from pteris semiinnata l. on proliferation of nonsmall cell lung cancer ncih460 cells. methods ncih460 cell growth inhibition mediated by 5f was detected by mtt. pihoechst double staining and tunel assay were used to observe cell apoptosis. flow cytometer was used to determine the effect of 5f on the content of dna in cells. results 5f displayed growth inhibitory activity against ncih460 cells with ic50 values of 21.40,4.52 and 1.02 μg/ml at the point of 24, 48 and 72 hours. 5f could induce apoptosis. ncih460 cells treated by 5f were arrestet in g2/m. conclusion in vitro 5f significantly inhibited the proliferation of ncih460 cells and the activity might be realized through inducing apoptosis.
key words：pteris semiinnata l; 5f; ncih460; proliferation inhibited
半边旗（pteris semiinnata l.）是生长在我国南方的传统中草药，民间用其来治疗感染性疾病。wWW.11665.com从半边旗中分离提取到一些具有生物活性的物质，以5f含量最高，其结构为二萜类化合物，见图1。化学结构名为11α羟基15氧16烯对映贝壳杉烷19酸（ent11αhydroxy15oxokaur 16en19oic acid）。本课题研究表明5f在体外能抑制多种癌细胞的生长并诱导凋亡的发生；能明显减小k562、s180等瘤株在小鼠所形成的肿瘤大小，延长小鼠存活时间[13]。
肺癌是目前全世界人类最主要的癌症死因之一，其中75%～80%为非小细胞肺癌（nsnlc）， 晚期肺癌患者仅有2%存活率超过5年，通常不满1年。近年来，对肺癌患者的治疗还是以化疗和放疗为主导，这些治疗药物和措施会给患者带来极大的痛苦，因此，从天然植物中提取具有抑制肺癌细胞生长的高效低毒的化合物已经成为抗肿瘤研究的热点。本研究旨在探讨5f对非小细胞肺癌ncih460细胞生长的抑制作用及可能的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
从植物半边旗中提取的5f，纯度为100%，使用前溶于dmso。
mtt、hoechst33342、pi为sigma公司产品；超级无支原体新生牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司；rpmi1640购自美国hyclone公司；胰酶购自美国gibco公司；细胞凋亡检测试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品；其余试剂均为国产分析纯。
非小细胞肺癌nci－h460细胞由本室传代。
1.2 方法
1.2.１ 细胞培养
ncih460细胞培养于含10%小牛血清，100ku/l青霉素和100mg/l链霉素的rpmi1640培养液中，37℃、5% co2饱和湿度细胞培养箱培养。取对数生长期细胞用于实验。
1.2.２ mtt法检测5f对ncih460细胞的生长抑制作用
取对数生长期的ncih460细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，rpmi1640完全培养液调制成2.0×104/ml细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种100μl（含2.0×103个细胞）。培养过夜后，吸出培养液，加入新培养液90μl及不同浓度的5f药液10μl，使终浓度分别为5、10、20、40、80μg/ml。同时设置adm阳性对照组，空白对照组加入相同体积的培养液，每一浓度设8个平行孔。继续培养24、48、72h。每孔加入mtt(5g/l)20μl，继续培养4～6h。每孔加入dmso 100μl。在微型振荡器上摇匀15min，结晶溶解后，立即比色，用elx800型酶标仪在主波长为570nm，参比波长为630处测量od值，比色以空白孔调零。实验重复3次。
抑制率=（1-实验组8孔od值平均值/对照组8孔od值平均值）×100%。
bliss方法计算半数抑制浓度ic50。
1.2.３ 荧光显微镜观察细胞形态
取对数生长期细胞， 调整细胞浓度为2.0×10５/ml， 加１ml到预先放置盖玻片的6孔板中， 24h待细胞爬片后， 加入不同浓度的5f药液， 使其终浓度为5、 10、 20μg/ml， 继续培养24h后， 用预冷的pbs洗涤2次， 加入hoechst33342 37℃染色15min， pbs洗涤2次， 再加入pi染色液于冰上染色15min, pbs洗涤2次,于荧光显微镜下观察并拍照。
1.2.４ 流式细胞仪检测dna含量的变化
参照文献介绍的方法略加改进，1 000r/min, 离心5min收集药物处理组和对照组细胞，pbs洗涤2次，体积分数为70%的乙醇-20℃固定24h以上，pbs离心洗去乙醇后加pi染液(含50mg/l pi，10mg/l rnasea，0.1% tritonx100, 0.1%柠檬酸钠和0.5%nacl),室温下避光染色30min，400目筛网过滤,用epicsxl型(美国)流式细胞仪检测dna含量，实验重复3次。
1.2.５ 细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡
取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2.0×10５个/ml，加１ml到预先放置盖玻片的6孔板中，24h待细胞爬片后，加入不同浓度的5f药液，使其终浓度为5、10、20μg/ml，继续培养24h后，用４%多聚甲醛／0.01m pbs室温下固定60min，余下步骤按试剂盒说明书进行操作。
２ 结果
2.1 5f对ncih460细胞生长的抑制作用
从表１和图2的结果可以看出，5f能明显抑制ncih460细胞的生长，其效果与时间和浓度相关。5、10、20、40、80μg/ml的5f在作用细胞48h后效果与阳性对照药adm相近。5f作用ncih460细胞24、48、72h的ic５０分别为：21.40、4.52、1.02μg/ml。
2.2 荧光显微镜观察5f对ncih460细胞的影响
经pihoechst双染的ncih460细胞， 对照组细胞核大小较均一， 呈圆形或椭圆形， 染色质分布均匀， 此外光下显蓝色荧光， 出现个别坏死细胞， 见图3a。 而经5f处理24h后的ncih460细胞细胞形态则出现不同程度皱缩， 变形， 染色质浓缩， 部分细胞核染色体碎裂， 并有凋亡小体出现， 见图3b～d。 且细胞凋亡形态出现的多少与5f的浓度相关。
2.3 流式细胞仪检测细胞dna的变化
5f作用细胞24、48h后ncih460细胞的dna含量发生变化。随着5f作用终浓度的增加（5～40μg/ml），g0/g1期dna出现含量降低，s期表1 5f对ncih460细胞的生长抑制作用表2 5f处理ncih460细胞不同时相dna含量的影响变化不明显，g2/m显著增加。提示5f可以将ncih460细胞阻滞在g2/m期，见表2。
2.４ tunel法检测5f对ncih460细胞凋亡的影响
tunel法检测显示正常对照细胞不显深棕黄色,而经5f处理后的细胞胞核呈深棕黄色，表现为形态皱缩,核固缩,凝集成块，并形成凋亡小体，其凋亡数与5f剂量呈正相关，见图4。
3 讨论
临床上用于治疗肿瘤的热疗、放疗、化疗及生物疗法一直被用于杀死肿瘤细胞，随着肿瘤的治疗正朝着日益完善的综合治疗方向迈进，尤其近十几年迅速发展的生物治疗给人们带来了新的希望，但目前化学药物治疗在临床上依然起着重要作用。由于化疗药物的毒副作用及易产生耐药性等缺陷，从天然产物中筛选新的高效低毒的抗肿瘤药仍然是当务之急。本课题对半边旗的有效活性成分及提取工艺进行了详细的研究[46]，多年的实验证实其二萜类提取物5f 在体外可致人的多种癌细胞死亡，主要作用机制是诱导肿瘤细胞凋亡并能抑制肿瘤细胞的迁移[79]。
细胞凋亡(apoptosis)是细胞在其生长、发育过程中发生的一种复杂的生理和病理过程，对机体的正常发育和自身稳定起着极其重要的作用。凋亡细胞的特征是细胞体积缩小，随即与邻近细胞的连接丧失，彼此脱离，失去微绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质浓缩呈块、团，典型的为半月形，凝聚于核膜周边，核仁裂解，进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个具有完整膜性结构，内含各种细胞成分的凋亡小体。不少疾病(包括肿瘤)的发病与凋亡受抑制有关，许多抗癌药物都是通过最终触发肿瘤细胞凋亡通路达到治疗的目的[6]。大多数抗癌药物都可引起肿瘤细胞的凋亡，诱导细胞凋亡可能是抗癌药物发挥作用的共同通路，所以细胞凋亡成为评估抗癌药物作用能力的一项重要指标。
细胞的生长增殖，24、48、72h的ic50分别为：21.40、4.52、1.02μg/ml，5f对其的生长抑制作用呈浓度－剂量及时间－剂量关系；荧光双染的结果显示经不同浓度的5f处理24h后的ncih460细胞细胞形态出现不同程度皱缩，变形，染色质浓缩，部分细胞核染色体碎裂，并伴有凋亡小体出现，细胞凋亡形态出现的数量与5f的作用浓度有关,这提示5f体外对ncih460的生长抑制作用可能与其诱导凋亡有关；流式细胞仪检测结果发现细胞被阻滞在g2/m期，但5f终浓度为40μg/ml时，细胞周期各时相均出现不同程度的改变，这可能与高浓度5f直接杀伤细胞，表现出细胞毒作用有关；进一步用tunel法进行凋亡检测证实了5f抑制ncih460生长的作用是由其诱导凋亡而产生的。提示5f具有诱导ncih460细胞凋亡的能力，是一种值得深入研究的新型抗肿瘤候选化合物。
【参考文献】
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