【摘要】 目的 克隆天花粉蛋白(trichosanthin,tcs)的cdna， 构建原核表达tcs的质粒，从表达菌中分离纯化重组天花粉蛋白（rtcs）后，分析rtcs和ntcs（天然天花粉蛋白）对宫颈癌hela细胞增殖的影响。方法 rt²pcr技术从新鲜栝楼叶片中扩增tcs cdna， 测序鉴定后克隆入表达载体pet²28a(+) 并转化入bl21(de3)细胞。iptg诱导表达后，用金属镍螯合层析法纯化rtcs蛋白, mtt法分别检测rtcs 和ntcs处理24、48和72h对宫颈癌hela细胞增殖的影响。结果 1. 成功克隆获得tcs的cdna并构建 pet²28a (+)²tcs原核表达质粒； 该cdna的碱基序列与基因库中注册的序列99.4%同源；2.在bl21(de3)菌中，iptg可诱导重组tcs蛋白表达，且表达的tcs主要以包含体的形式存在。在一定的时间范围内（0～8h）；rtcs的表达水平与诱导时间正相关；3. 用ni²nta树脂亲和层析法，从诱导表达菌中获得了高纯度的重组tcs蛋白；4. mtt法分析表明，rtcs和ntcs均对hela宫颈癌细胞的生长具有抑制作用。在0～100μg/ml的浓度范围内， 随着药物浓度的增加及作用时间的延长，rtcs和ntcs对hela细胞的生长抑制率逐渐增大，且各组之间差异有统计学意义（p﹤0.05）；rtcs的ic50小于ntcs。结论 本实验克隆了tcs的cdna， 构建了表达载体pet²28a (+)²tcs，并成功地在e.coli中原核表达和纯化出重组tcs蛋白，发现纯化的rtcs和ntcs对hela细胞的生长都有明显抑制作用，并且rtcs的细胞毒性小于ntcs。wwW.11665.cOm
【关键词】 天花粉蛋白 基因重组蛋白 hela细胞
0 引言
天花粉蛋白(trichosanthin,tcs)是从葫芦科植物栝楼的块根中提取的单链核糖体失活蛋白。通过对天花粉蛋白进行药理学、病理学、免疫学的研究,已经明确它具有引产[1]、抗肿瘤[2²3]、抗病毒[4]等生物学活性。由于天然天花粉蛋白资源有限，分离纯化困难，而且天花粉蛋白作为一种大分子的天然植物蛋白，具有一定免疫原性和过敏性，也阻碍了天花粉蛋白的临床应用[5]。因此对天花粉蛋白进行基因工程表达以及重组天花粉蛋白生物学活性研究已成为当前的研究热点。
本研究采用rt²pcr的方法从神农架的新鲜栝楼叶片中克隆tcs cdna，构建原核表达质粒pet²28a(+)²tcs。在e.coli中诱导表达的重组天花粉蛋白经纯化后，分析了它和天然天花粉蛋白对hela细胞生长的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
新鲜栝楼叶片采自湖北省神农架木鱼镇；原核表达载体pet²28a (+)购自novagen公司；e.coli菌株bl21(de3) 和dh5a由本研究所保藏；trizol总rna抽提试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司；access rt²pcr introductory system购自promega公司；工具酶、蛋白质分子量标准购自fermentas公司；dna凝胶回收试剂盒购自takara公司；dna小量提取试剂盒购自上海捷瑞生物技术有限公司；异丙基β²d ²硫化半乳糖苷( iptg) 购自武汉兴华基因公司；ni2+²nta亲和层析柱购自海门公司，ni2+²nta his²bind resin纯化试剂购自novagen公司；鼠抗his抗体及辣根过氧化物酶标记兔抗鼠二抗购自santa cruz公司，pvdf膜和ecl发光检测试剂盒购自amersham公司；天然天花粉蛋白（ntcs）注射液购自上海金山制药有限公司； rpmi²1640培养基和小牛血清（bcs）购自美国gibico公司；噻唑蓝（mtt）购自amresco公司；pcr引物合成与dna测序由上海生物技术工程有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 rt²pcr克隆tcs cdna trizol试剂用于从新鲜栝楼叶片匀浆中提取细胞总rna。以此总rna为模板，采用rt²pcr一步法（promega公司access rt²pcr试剂盒）扩增tcs的cdna。pcr产物在1%琼脂糖凝胶中电泳分离，切胶回收（takara公司dna回收试剂盒）后，溶于25μl te备用。pcr所用引物的碱基序列为：
p1: 5ð²gaattcatgatcagattctta
p2: 5ð²aagctttaaatagcataacttccac
为了基因操作方便, 两引物的5ð端分别引入了ecorⅰ和hindⅲ酶切位点（下划线标记）。
1.2.2 pet²28a(+)²tcs重组质粒构建与tcs原核表达 将切胶回收的目的片段和表达载体pet²28a(+)用限制性内切酶ecorⅰ和hindⅲ进行消化,回收酶切的目的片段和载体,并将两个片段按分子比3∶1的比例进行连接。连接产物转化克隆菌dh5a后， 在含有卡那霉素（50mg/l）的lb琼脂板中筛选。随机挑取成功转化的单克隆细菌, 进行质粒dna的小量抽提，经ecorⅰ和hindⅲ双酶切及dna测序鉴定后，重组质粒被转化入原核表达菌bl21(de3)中。接种含重组载体的表达菌株于lb液体培养基中(含卡那霉素50mg/l)，230r/min 37℃ 振摇培养至od600值达0.6～0.8，加入iptg至终浓度为1mmol/l。在加入iptg后的第2、4、6、8h收集菌液，5000g离心10min收集沉淀，部分细菌样品经12% sds²page分析tcs最适表达时间， 部分细菌样品重悬于1/20细菌生长体积的冰预冷的超声破碎缓冲液(1×pbs，5mmol/l edta,ph8.0)中,超声破碎细菌，12000g 离心10min后，分别收集上清和沉淀，进行sds²page以分析tcs是否主要以包含体的形式存在。
1.2.3 western blot分析鉴定rtcs蛋白 取诱导前后的菌液样品进行12%sds²page电泳分离，电转至pvdf膜。膜用50g/ l脱脂奶粉37℃封闭1h后， pbst 洗膜3次， 然后与1∶2000稀释的anti²his抗体4℃孵育过夜，pbst 洗去未结合的一抗，加二抗（1∶3000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体）并37℃孵育1h，pbst洗涤3次，ecl反应液显色。
1.2.4 rtcs的纯化和复性 收集iptg诱导8h的菌液， 5000r/min离心10min，收集沉淀并称重，以5ml/g加入buffer b(8m urea、0.1m na2hpo4、0.01m tris²hcl、ph8.0)重悬，室温裂解1h， 12000r/min 离心20min，收集上清，加入2mlni2+²nta树脂，室温振荡1h后装柱，5倍nta树脂体积的wash buffer (同buffer b，ph6.3)洗脱非特异吸附蛋白， 流速为30ml/h。再用buffer d(同buffer b，ph5.9)和buffer e(同buffer b，ph4.3)选择性洗脱吸附在树脂上的rtcs, 流速控制在15ml/h, 分段收集洗脱液。纯化蛋白经过透析复性（透析缓冲液为250mm nacl，50mm tris²hcl ，ph=8.0，0.1mm edta，1mm dtt, 每12小时递减urea浓度, 分别为5m、2.5m、1m、0m）,考马斯亮蓝法测定纯化蛋白的浓度后, 置-20℃贮存备用。
1.2.5 细胞培养 人宫颈癌hela细胞株由三峡大学分子生物研究所提供，培养于5% co2、37℃湿化孵箱中，rpmi²1640培养基含体积分数10%bcs、1×105 u/l 青霉素、100mg/l 链霉素。
1.2.6 mtt法检测tcs对hela细胞增殖的影响 将hela细胞接种于96孔细胞培养板内（每孔103个细胞），待细胞贴壁后，对照组换新鲜rpmi²1640培养液，实验组分别换用含有不同浓度的rtcs或ntcs的培养液，每个浓度做3个复孔，置于co2培养箱内分别培养24h、48h、72h。弃尽孔内培养液，每孔加入2mg/ml mtt 100μl，继续培养4h。终止培养，弃尽孔内培养液，每孔再加入100μl的dmso，振荡30min后，测定570nm波长处的光吸收值（od570nm）。细胞生长相对抑制率（ir）= (1-od药物/od对照)×100%。用logit法计算半数抑制率(ic50)。
1.3 统计学方法
实验结果用spss10.0统计软件进行分析。
2 结果
2.1 tcs cdna克隆和原核表达质粒构建
以新鲜栝楼叶片匀浆提取的细胞总rna为模板，通过rt²pcr反应获得tcs的cdna，该cdna包含tcs蛋白编码的完整开放性阅读框架。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，在约870bp处呈现1条与预期产物相对分子量大小相符的dna条带，而未加模板的空白对照孔无相应条带。扩增产物经核苷酸测序分析，与genebank中已有的序列（检索号ay082349）99.4%同源。扩增片段回收纯化后，用ecorⅰ+hindⅲ双酶切并连接到用相同酶消化的pet²28a(+)载体。成功构建的重组质粒pet²28a(+)²tcs用ecorⅰ和hindⅲ双酶切，产生5365bp和874bp两个片段; 再分别用ecorⅴ和ncoⅰ单酶切鉴定, 重组质粒分别产生4544bp和1555bp及921bp和5298bp两个片段, 与理论预期值一致，见图1。
1：dna marker;2:pet²28a(+)²tcs;3： pet²28a(+)²tcs/ecor+ hindⅲ; 4： pet²28a(+)²tcs /ecorⅴ; 5： pet²28a(+)²tcs /ncoi
图1 重组质粒的限制性酶切图谱（略）
fig 1 the restriction map of recombinant plasmid pet²28a(+)²tcs
2.2 tcs在大肠杆菌中的诱导表达
将酶切鉴定正确的重组质粒转化表达菌种bl21(de3)， 经iptg在37℃诱导表达2～8h后，12% sds²page分析表明，诱导后的菌液在分子量27kd处有一明显新生蛋白条带，诱导8h时条带最明显，见图2。将诱导菌超声破碎，离心后分别取上清和沉淀进行sds²page分析，结果显示，重组tcs蛋白主要以包含体形式存在，见图3。
1：protein marker;2～6： bl21(de3) transformed with pet²28a(+)²tcs and induced by iptg for 0、2、4、6、8h at 37℃ respectively
图2 sds²page电泳分析重组蛋白在bl21(de3)中的表达（略）
fig 2 sds²page analysis for recombinant tcs expression in bl21(de3)
1： protein marker; 2： bl21(de3) transformed with pet²28a(+)²tcs /before iptg; 3、4： supernatant and precipitate of sonicated bl21(de3) transformed with pet²28a(+)²tcs/after iptg
图3 sds²page电泳分析rtcs在e. coli内的存在方式（略）
fig 3 analysis of existent manner of recombinant tcs in e.coli
2.3 rtcs的免疫印迹分析
用iptg诱导不同时间的表达菌样品进行western blot分析， 结果显示有能与抗his标签抗体作用的阳性条带，分子量与预期的rtcs一致，且发现0～8h内，重组蛋白的表达量与诱导时间成正比，见图4。
1～5: were samples of bl21(de3) transformed with pet²28a(+)²tcs after induced by iptg for 0、2、4、6、8h respectively
图4 western blot分析rtcs在bl21(de3)中的表达（略）
fig 4 western blot analysis of recombinant tcs expression in bl21(de3)
2.4 rtcs 的ni²nta亲和层析纯化
在bl21(de3)中表达的tcs因在其n²末端加上了6xhis²tag，因而我们用能特异性结合6xhis的ni²nta树脂对其进行纯化，获得的rtcs经sds²page分析证实有较高的纯度，见图5。
1:protein marker;2: bl21(de3) transformed with pet²28a(+)²tcs before iptg induction;3: bl21(de3) transformed with pet²28a(+)²tcs after iptg induction for 8h; 4:purified rtcs
图5 ni²nta亲和层析纯化的rtcs（略）
fig 5 analysis of purified recombinant tcs by ni²nta
2.5 tcs对hela细胞生长的抑制作用
mtt结果显示，rtcs和ntcs对hela细胞的生长都有明显抑制作用，见表1。以药物浓度及作用时间作two²way anova分析，结果显示在0～100μg/ml的浓度范围内, 随着药物浓度的增加及作用时间的延长，rtcs和ntcs对hela细胞的生长抑制率逐渐增大，且各组之间差异有统计学意义（p＜0.05）。t²test结果显示两药的log ic50差异有统计学意义(p<0.05), rtcs处理组的ic50值均小于ntcs处理组,说明rtcs的细胞毒性小于ntcs。
表1 天花粉蛋白体外对hela细胞增殖的影响（略）
tab 1 the effect of tcss on proliferation of hela cells
a:p＜0.05; b：p＜0.01 vs. the group of 0μg/ml tcs;c：p＜0.05 vs. the group of ntcs
3 讨论
天花粉蛋白的成熟肽由247个氨基酸残基组成，分子量约为24kd，pi=9.4，具有n²糖苷酶活性，能水解真核细胞核糖体的28s rrna的4324位上的腺苷酸的n²c糖苷键，使核糖体不可逆失活，从而抑制蛋白质的合成[6]。此外tcs还具有类似dna解旋酶的活性，可以切割超螺旋dna产生开环和线性dna[7]。目前,已报道常用的从栝楼块根中纯化天花粉蛋白的方法有丙酮沉淀、离子交换层析、反相hplc、blue²sepharosecl²6b柱层析及批量结晶等,另有文献报道可通过自由流动电泳(ffe)从丙酮分级沉淀的粗提品中纯化天花粉蛋白[8]。另外,还可以采用这些方法从栝楼种子中纯化一种新的核糖体失活蛋白肽[9],但这些方法均较为复杂,费时较长,纯化过程易造成损失,影响产率。解决上述问题的可能途径之一，是利用基因工程技术对tcs进行大量制备。
目前对天花粉蛋白的分子结构，基因序列以及蛋白质构象都已进行了深入研究[10]。本实验成功地从新鲜栝楼叶片获得tcs的cdna，构建了原核表达质粒pet²28a(+)²tcs，转化e.coli宿主菌后，利用iptg可诱导e.coli在短期内表达rtcs。rtcs携带6个组氨酸，组氨酸的咪唑基团提供电子与金属镍离子亲和,之后通过改变洗脱液的ph值来改变咪唑基团与金属镍的亲和力，从而达到纯化rtcs的目的。金属镍螯合层析系统对rtcs具有高效吸附作用，蛋白质在后继的分离纯化过程中仍然保持较高活性，方法简单易行，且层析柱易于再生，成本很低。
mtt分析法近年来已被广泛用于肿瘤细胞生物学研究、抗癌新药的筛选以及指导临床。目前关于重组天花粉蛋白对hela细胞生长的影响未见报道，本实验首次证明了纯化的rtcs对hela细胞生长有明显的抑制作用，并且rtcs的细胞毒性小于ntcs。上述研究结果将为tcs大规模基因工程制备奠定基础。
【参考文献】
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