【摘要】 ［目的］ 了解cx32基因在肝癌细胞株（hepg2）中的表达及甲基化调节作用。［方法］ 采用不同药物浓度的甲基化转移酶抑制剂(5-杂氮脱氧胞苷5-aza-cdr)分三组培养细胞株，免疫组化分析cx32蛋白表达，甲基化特异性pcr检测cx32基因的甲基化状态。［结果］肝癌细胞株cx32蛋白表达减少，去甲基化后cx32基因表达增加且定位异常，细胞生长减慢，三组细胞总阳性率分别为18.5％、77％、88％，具有显著性差异(p＜0.01)。三组细胞cx32基因甲基特异性pcr结果分别为甲基化、部分去甲基化及完全去甲基化。［结论］肝癌细胞株（hepg2株）中cx32表达减少，受甲基化抑制，去甲基化可增加cx32表达。
【关键词】 肝肿瘤 连接蛋白32 甲基化
连接蛋白32（connexin32，cx32）是正常肝脏中主要表达的连接蛋白之一，对维持肝细胞的正常功能具有重要作用，cx32表达异常与肝癌的发生发展有关，是肝癌抑癌基因[1]，其下调机制不是很清楚。国外研究提示肾癌中cx32受到甲基化抑制[2]，本文进一步研究肝癌细胞中cx32表达下调是否与基因甲基化有关，探索增加或恢复肝细胞癌中cx32正常表达的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材 料
hepg2肝癌细胞株（湘雅医学院中心试验室细胞库提供）；鼠抗cx32及二抗试剂盒（zymed公司）；qiaamp dna抽提试剂盒(qiagen公司)；5-aza-cdr、亚硫酸氢那钠、氢醌（sigma公司）；dna纯化试剂盒(promega公司)。wWw.11665.CoM引物参照文献设计如下：甲基化引物：sense 5′-ggggcgggtgcggcgat-3′、antisense 5′-ctccgcgcctgcgccc-3′；非甲基化引物：sense5′-ggggtgggtgtggtgat-3′、antisense
5′-ctccacacctacacccaa-3′。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，od值均为2，扩增片段均为245bp。
1.2 研究方法
细胞培养及处理：肝癌细胞株（hepg2）采用含双抗（青霉素、链霉素100u/l）及10％胎牛血清的高糖型dmem培养，按不同5-aza-cdr浓度分三组（0μmol/l组、1μmol/l组、5μmol/l组），分别在25cm2培养瓶和带玻片的6孔培养板中培养，每组培养瓶5瓶、培养板5板，重复3次。取对数期生长细胞，每瓶和每孔分别接种细胞2×104、8×103。先用不含药物的培养液培养24h待细胞贴壁后弃去培养液，换用含相应药物浓度的培养液继续培养72h，每天在显微镜下观察、计数细胞（计数按血细胞计数方法）一次，重复计数结果取均值列表并进行统计分析。
细胞免疫组化：按试剂盒说明采用abc三步法。结果判断：参照barnes等[3]方法进行半定量评分（分a、b项）：a项，按切片中细胞显色深浅计分：0分：细胞无显色，1分：显浅黄色，2分：显黄色，3分：显棕黄色；b项，按显色细胞的比例评分：1分：1%~30％，2分：31%~75％，3分：76%~100％。两项指标结合积分：阴性（-）积分为0分；阳性（+）积分1~4分；强阳性（++）积分5~6分。每组计数5个视野，每个视野计数200个细胞。
甲基化特异性pcr：参照说明提取、亚硫酸氢钠及氢醌等修饰、提纯dna，pcr反应体系50μl，反应条件：94℃变性2min；94℃变性30s、70℃退火1min、72℃延伸30s循环40次；72℃延伸5min。
1.3 结果判断
甲基化阳性为m阳性、u阴性；部分去甲基化为m阳性、u阳性，但od值减弱；完全去甲基化为m阴性、u阳性。
1.4 统计学处理
采用spss13.0统计软件包，分别采用多因素方差（manova）分析、kruskal-wallis h检验和nemenyi检验，p＜0.05有统计学意义。
2 结 果
2.1 细胞培养结果
显微镜下观察细胞培养，随着5-aza-cdr的剂量递增，细胞数增殖减慢，细胞形态变得较规则，病理性分裂减少。各组细胞计数结果取均值列表（见表1）， manova分析，具有显著性差异（f=56.13，p＜0.01）。
2.2 细胞免疫组化结果
结果表明：kruskal-wallis h检验 h＝204.32，p＜0.01；采用nemenyi法检验两两比较，χ21,2＝258.33，χ21,3＝391.83，χ22,3＝13.85，p值均＜0.01。表明经甲基化酶抑制剂处理后cx32表达定位异常（主要表达于胞浆）、表达增加，各组间差异均有显著性，即2组高于1组，3组高于2组。见表2，图1~5。
2.3 甲基化检测结果
甲基化检测结果见图6。1组为甲基化（m）阳性而去甲基化（u）阴性；2组为部分甲基化阳性即甲基化（m）阳性，去甲基化（u）也为阳性但od值减弱；3组则完全逆转，甲基化（m）阴性而去甲基化（u）阳性。
3 讨 论
cx作为细胞间隙连接通讯（gap junctional intercellular communication，gjic）的结构基础在多细胞生物中表达。对细胞生长、增殖、分化、维持内环境稳定等起着重要的调节作用[4]。近年大量研究显示cx在多种肿瘤中表达减少，属于抑癌基因，与多种肿瘤包括肝细胞癌的发生、发展有关，但是cx在肿瘤表达下降的机制不很清楚，国内外相关研究也不是很多。dna甲基化通常发生在基因启动子区域cpg岛中的胞嘧啶部位形成cmpg，使基因变构，直接或间接抑制基因转录，是一种很常见的抑癌基因沉默机制，已经在多种抑癌基因中得到证实。有关cx抑癌基因的甲基化调节目前研究不多，cx32基因启动子富含cpg岛，已经在肾癌中证实其表达下降的原因与甲基化有关。肝细胞癌中cx32表达减少，可能也与其基因甲基化有关，目前国内外尚未见确切报道。本文利用不同浓度的甲基化转移酶抑制剂（5-aza-cdr）干预hepg2肝癌细胞株，结果显示未干预组，cx32基因蛋白质表达减少，甲基化阳性，细胞生长快，病理性核分裂较多；药物干预后cx32基因部分或完全去甲基化，基因蛋白质表达增加、定位异常，与干预剂量呈正相关，细胞生长减慢，恶性程度下降。统计学分析差异具有显著性。这一结果与国内外研究一致。表明肝癌细胞株中cx32的表达受基因甲基化的抑制，去甲基化可以增加表达，定位异常提示还受到其他因素的调节，如翻译后磷酸化修饰、ca2+、camp浓度等[5，6]都可以影响cx32的装配和转运而导致定位异常。随着cx32表达增加，细胞生长减慢，恶性程度下降，再次证实cx32具有抑制肿瘤生长的作用，当然也可能5-aza-cdr的强有效去甲基化作用，使其他抑癌基因表达增加，协同抑制肿瘤生长的结果。通过本研究，对于cx32的调节机制、抑癌作用有了更加深入的认识，对于肝癌及其他受到cx32抑制的恶性肿瘤的诊治提供一定的实验依据。
【参考文献】
[1] fujimoto e, sato h, shirai s, et al. connexin 32 as a tumor suppressor gene in a metastatic renal cell carcinoma cell line[j]. oncogene, 2005, 24(22):3684-3690.
[2] ayako h, yyano t, nishikawa k, et al. down-regulation of connexin32 gene expression through dna methylation in a human renal cell carcinoma cell[j]. am j nephrol, 2003, 23(3):172-177.
[3] barnes dm, dublin ea, fisher cj, et al. immunohistochemical detection of p53 protein in mammary carcinoma: an important new independent indicator of prognosis[j]. hum pathol, 1993, 24（5）:469-476.
[4] tano t, fujinoto e, habiwara h, et al. connexin 32 as an anti-invasive and anti-metastatic gene in renal cell carcinoma[j]. biol pharm bull, 2006, 29(10):1991-1994.
[5] matesic df, rupp hl, bonney wj, et al. changes in gap-junction permeability, phosphorylation and number mediated by phorbol ester and non-phorbol-ester tumor promoters in rat liver epithelial cells[j]. mol carcinogenesis, 1994, 10(4):226.
