【摘要】 目的 探讨选择性环氧化酶2（cyclooxygenase2，cox2）抑制剂塞来昔布（celecoxib）联合5氟尿嘧啶（5fluorouracil ，5fu）对实验性人结肠癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响及作用机制。方法 建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型，模型建立后32只实验裸鼠随机分为四组，分别给予塞来昔布及5fu药物干预后观察各组皮下移植瘤体积、瘤重和裸鼠实验前后的体重变化，计算抑瘤率。电镜观察细胞凋亡形态,原位凋亡染色检测凋亡指数（ai），免疫组化及western blot印迹法检测细胞色素c、caspase3及caspase9表达。结果 塞来昔布干预组、5fu干预组和联合干预组肿瘤生长明显抑制，塞来昔布干预组、5fu干预组抑瘤率分别为27.81%和53.02%，联合干预组抑瘤率为78.37%（p<0.01）。干预组较对照组肿瘤细胞凋亡明显增加，干预组各组之间凋亡指数比较差异有统计学意义（p<0.01）。透射电镜下见干预组瘤细胞呈现明显凋亡形态改变，联合干预组凋亡表现尤为典型，对照组无明显凋亡形态改变。免疫组化及western blot印迹法显示干预组其细胞色素c、caspase3及caspase9的表达明显高于对照组，且干预组各组之间比较其表达差异也有统计学意义（p<0.05）。结论 塞来昔布及5fu均具有明显的抗肿瘤作用，联合应用时具有协同作用，可显著抑制人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的生长，其作用机制可能与上调细胞色素c、caspase3及caspase9蛋白表达、激活细胞色素c依赖性凋亡信号通路有关。Www.11665.CoM
【关键词】 结肠癌 塞来昔布 细胞色素c 细胞凋亡 信号转导
近年来研究表明, 环氧化酶2（cox2）过表达与肿瘤,特别是消化道肿瘤的发生发展密切相关，而选择性cox2抑制剂对多种实体肿瘤包括结肠癌的生长均有抑制作用，并也有报道它还可增强多种化疗药物对肿瘤的杀伤作用[1]。本研究利用选择性cox2性抑制剂塞来昔布联合5fu对实验性人结肠癌裸鼠皮下移植瘤进行干预，探讨联合治疗对肿瘤生长的影响及可能的作用机制，为选择性cox2抑制剂进一步运用于肿瘤临床联合治疗提供实验和理论依据。
1 材料和方法
1.1 细胞系和实验动物
人结肠癌ht29细胞株购自于中国科学院上海细胞生物研究所。4～5周龄balb/c nu/nu 雌性裸鼠（体重15～17g）32只,购自中国科学院上海试验动物中心（获合格证书），spf级环境饲养。
1.2 药物和试剂
塞来昔布（celecoxib ，生产批号639t）购自美国辉瑞公司，鼠抗人细胞色素c抗体、caspase9抗体及caspase3抗体均购自santa cruz公司。bactin抗体(鼠源性)为苏州大学血液研究所提供。mccoy′s 5a培养液（含谷氨酰胺和10％胎牛血清）购自gibco公司。辣根过氧化酶(hrp)标记羊抗鼠、兔抗羊二抗及nc膜购自华美生物工程公司，tunel试剂盒购自roche公司，ecl western印迹检测试剂盒购自sigma公司。
1.3 细胞培养及结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型
人大肠癌细胞株ht29采用mccoy′s 5a细胞培养基（含谷氨酰胺和10％胎牛血清），常规培养于含5％co2的37℃培养箱中，当细胞达70％～80％融合时，用0．25％胰酶消化传代继续培养。收集对数生长期ht29细胞，接种于裸小鼠背部靠近后肢部位皮下，每只裸鼠接种约8×106个细胞，接种完毕后采用区组随机化法随机分为四组，spf级环境下饲养1周，皮下成瘤直径均可达0.5cm左右，成瘤率为100％。对照组（a组）为纯水自由摄入，b组为塞来昔布干预组（1 500ppm,1.5mg/ml）,c组为5fu干预组（20mg/kg）,d组为塞来昔布与5fu联合干预组（塞来昔布1 500ppm + 5fu 20mg/kg）。塞来昔布给药方式为消毒蒸馏水溶解塞来昔布配制成新鲜溶液，裸鼠每日饮水自由摄入至实验结束。5fu给药方式为裸鼠腹腔注射，分组后当天给药，每日给药1次，连续给药5天，每只裸鼠根据体重计算所需用药剂量，并调整注射液体量为每只裸鼠注射1ml,a组与b组裸鼠予生理盐水1ml作为溶媒，分组后当天即给予腹腔注射，连续5天，每天注射1次。观察28天后处死裸鼠，解剖剥取肿瘤标本，用游标卡尺测量瘤块的长度（a）和宽度（b），按照公式计算肿瘤的近似体积（v）：v＝a × b2 /2。瘤块称重并计算抑瘤率(%)=[(对照组平均瘤重－治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％。
1.4 tunel法检测凋亡细胞
按试剂盒所提供说明书操作。凋亡细胞胞核染色成黑褐色，而未凋亡细胞的细胞核呈淡蓝色。每张切片选取10个高倍视野(×400) ,计数1 000个细胞中的阳性细胞数,凋亡率(％) =(凋亡阳性细胞数/1 000)×100％ 。
1.5 透射电镜检测细胞凋亡
取移植瘤组织块60mg固定于2.5%戊二醛2小时以上后用70%乙醇配制饱和醋酸铀，搅拌30min后静置，以磷酸缓冲液漂洗3次后用4%锇酸固定，50%乙醇漂洗后包埋剂复温，将样品放入胶囊，烤箱63℃聚合72h，48h后溶胶囊，电镜下观察凋亡情况，拍照，洗片。
1.6 免疫组化法检测细胞色素c、caspase3与caspase9的表达
移植瘤组织石蜡切片常规脱蜡，梯度酒精水化，1％h2o2封闭15min,0.01mol/l pbs洗涤,微波抗原修复。2％正常羊血清封闭1h,分别滴加鼠抗人caspase3、caspase9单克隆抗体一抗（均为1∶1 000），细胞色素c单抗（1∶500）, 4℃孵育过夜, pbs洗涤后滴加hrp标记的二抗( 1∶200)室温孵育2h,dab显色15min,苏木素复染。
阳性结果判断：免疫组织化学阳性表达为境界清楚，突出背景的棕黄色或棕褐色颗粒，选择5个以上高倍视野，计数不少于500个结肠粘膜细胞中的阳性细胞。用半定量法即肿瘤细胞阳性率与染色强度评分的乘积来表示分别推算整个肿瘤组织中细胞色素c、caspase3与caspase9的表达情况，分别按以下比例记分：肿瘤细胞染色率在0～ 4％记0分、5%～ 24％记1分、25％～ 49％记2分、50％～ 74％记3分、75％～ 100％记4分，染色强度用0分（阴性）、1分（弱阳性）、2分（阳性）来表示。具体结果分析按krajewska等[2]推荐方法进行。
1.7 western blot印迹测定细胞色素c、caspase9和caspase3蛋白表达
取裸鼠新鲜瘤组织约40mg迅速置于预冷的生理盐水中预处理后放入机械组织匀浆器中，加入裂解液进行匀浆，离心收集上清并加入laemmli样品缓冲液水浴加热、离心，提取总蛋白。每组各取100μg总蛋白样品在sds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至nc膜，分别将鼠源性一抗细胞色素c(1∶500)、鼠源性一抗caspase9 (1∶1 000)和鼠源性一抗caspase3 (1∶1 000)与膜孵育1h，pbs洗膜。hrp标记羊抗鼠二抗(1∶500)与膜孵育1h。用同样方法标记鼠单克隆抗体βactin作内对照。ecl试剂盒检测蛋白信号。
1.8 统计学方法
用spss11.0统计软件包对数据进行统计学分析。所有数据用±s表示，各均数间比较采用方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 塞来昔布与5fu对皮下移植瘤生长的影响
干预组与对照组相比，移植瘤体积显著缩小，瘤重明显减轻，两两比较差异均有统计学意义（p<0.05）,a、b、c和d组抑瘤率分别为0，27.81％,53.02％和78.37％，干预组抑瘤率明显高于对照组，尤以联合治疗组抑瘤率最高，瘤体体积最小、瘤重最轻，差异具有统计学意义（p<0.01），见表1、图1。表1 各组移植瘤大小和瘤鼠体重变化比较（±s）
tab 1 tumor size and mouse weight（±s）
组别瘤体体积（cm3）瘤体重量（g）wewt（g）△a组0.5367±0.05320.5924±0.0612-0.1723±3.0014 b组0.3429±0.0875*0.4276±0.0629**1.7286±1.5298***c组0.1947±0.0386*0.2783±0.0314**2.7518±1.6186***d组0.0428±0.0236*0.1281±0.0219**-0.6471±1.2587***
各组之间瘤体积两两比较*p<0.05；各组之间瘤重两两比较**p<0.01；各组之间鼠重变化比较***p>0.05；△为实验结束时瘤鼠的重量实验开始时瘤鼠的重量2.2 塞来昔布与5fu对移植瘤肿瘤细胞凋亡的影响
tunel检测发现，各干预组中凋亡细胞数较对照组明显增多， 凋亡率从对照组9.5％分别上升至b、c、d组的47.5％、68.5％和80.1％，与对照组相比差异均具有统计学意义（p<0.01），见图2。透射电镜下干预组可见瘤细胞有凋亡形态改变，细胞外形多极不规则,胞体缩小,核缩小,核膜完整,核仁区完全消失, 染色质凝集、致密,向核膜下集中,部分线粒体肿胀膨大,细胞膜完整,核裂解,细胞间散在着膜包裹的凋亡小体,内含残核和细胞器，联合用药组(d组)上述凋亡表现尤为典型，而对照组则无上述表现，见图3。
2.3塞来昔布与5fu对各组移植瘤细胞胞浆中细胞色素c、caspase9和caspase3蛋白表达的影响
免疫组化检测发现细胞色素c、caspase9和caspase3蛋白主要表达在凋亡细胞中，在凋亡的肿瘤细胞中细胞色素c、caspase9和caspase3蛋白阳性表达的染色主要为胞质着色，少数为胞核及核膜着色，呈棕黄色颗粒。实验结果发现干预组细胞色素c、caspase9和caspase3蛋白的表达较对照组明显增加（p<0.05）, 且塞来昔布联合5fu组（d组）表达最强，其次依次为5fu单药干预组（c组）和塞来昔布单药干预组（b组）,各干预组间差异具有统计学意义（p<0.05），见表2。western blot印迹检测发现，胞质中细胞色素c、caspase9和caspase3的蛋白表达干预组明显高于对照组（a组），且塞来昔布联合5fu组（d组）表达最强，其次依次为5fu单药干预组（c组）和塞来昔布单药干预组（b组），见图4。
3 讨论
结肠癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，并呈逐年上升趋势,目前在我国为癌症发病率的第四位，男女发病率分别为37.2/10万和33.5/10万，并且结肠癌的死亡率很高，超过50%的结直肠癌会发展到晚期或发生转移[3]。结肠癌早期诊断困难，放疗、化疗仍然是其治疗的主要手段，5fu作为结肠癌临床化疗一线药物，单药有效率为24％～31％，加大剂量可能会出现严重的毒副作用，而且逐渐增加的耐药性也限制了其用量和疗效[4]。联合治疗是有可能进一步提高肿瘤病人化疗疗效，同时减少单药使用不良反应的抗肿瘤策略。
近年非细胞毒性药物在肿瘤治疗研究中受到关注[1],在非细胞毒性药物中,环氧化酶(cox)抑制剂在抑制肿瘤生长方面的研究已有很多进展。塞来昔布是一种高选择性cox2抑制剂，与传统的nsaids相比，塞来昔布药理作用更强且不良反应较少[3]。近来的一些研究发现，选择性cox2抑制剂可以提高肿瘤细胞对多种化疗药物的敏感性，使化疗药物的ic50下降近70％[5]。zheng [6]等以体外培养的多种肺癌细胞株作为研究对象，观察选择性cox2抑制剂尼米舒利对于多种抗肿瘤药物(包括ddp、vp16等)的影响，结果表明当尼米舒利与细胞毒化疗药物联合应用时，具有协同效应。张有成[7]等发现选择性cox2抑制剂ns398可增强5fu对结肠癌细胞的抑制作用。因此，本研究选择塞来昔布与5fu对实验性人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的生长进行干预，结果发现两者均对皮下移植瘤的生长具有明显抑制作用，塞来昔布干预组、5fu干预组和联合干预组抑瘤率分别为27.81％、53.02％和78.37％，与对照组比较差异具有统计学意义（p<0.05）,且干预组之间两两比较抑瘤率差异也具有统计学意义（p<0.01）。四组中联合用药组（d组）瘤体体积最小、瘤重最轻，抑瘤率最高。染色光镜及电镜下可见经药物干预的肿瘤细胞出现典型的凋亡形态学变化，细胞皱缩，细胞核体积缩小，核固缩，核破裂以及凋亡小体形成，凋亡改变尤以联合用药组最为明显。tunel法也表明联合药物干预组其tunel阳性率明显高于其余三组（p<0.01）。
为了进一步探讨塞来昔布化疗增敏作用的机制，我们检测了胞质中细胞色素c、caspase9 和 caspase3蛋白的表达，实验中免疫组化和westernblot结果均证实塞来昔布与5fu在诱导肿瘤细胞凋亡过程中均伴有细胞色素c蛋白表达明显上调，作为细胞色素c的下游信号cspase9与caspase3其蛋白表达同样明显上调，并且两药联合应用时蛋白表达上调尤为明显,提示两药联合应用时具有协同抗肿瘤作用，其作用机制可能与显著上调细胞色素c、caspase3及caspase9蛋白表达、激活细胞色素c依赖性凋亡信号通路有关。另有研究证实某些nsaids如消炎痛、舒林酸等通过可抑制与化疗药物外流有关的细胞膜上的跨膜蛋白atp依赖性流出泵(multidrug resistance associated protein，mrp)p2糖蛋白(p2170)的过度表达，以及抑制谷胱甘肽转移酶的活性，从而抑制化疗药物的细胞外流，增加化疗药物及其活性代谢产物在细胞内的浓度，减少肿瘤细胞对化疗药物的多药物耐受[8] (multiple drug resistance，mdr)，这一作用与cox2的酶活性无关，加入pgd2或pge2并不能逆转该作用，其机制不明。yipschneider[9]等实验表明，nsaids可增加胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性，其作用与nsaids对胰腺癌细胞的细胞周期阻滞作用有关，nsaids使胰腺癌细胞的cyclind1的表达下调，细胞阻滞于对吉西他滨敏感的g1期，使细胞对吉西他滨的反应性增加，增强了吉西他滨杀伤肿瘤的作用，并且cox2抑制剂还可能通过抑制血管生成而发挥化疗增敏作用。
目前研究表明，包括选择性cox2抑制剂在内的非甾体类抗炎药(nsaids)可增强多种肿瘤对化疗药物的敏感性，但其机制目前仍不明了，可能涉及多个分子机制。本实验在建立裸鼠皮下移植瘤模型的基础上应用塞来昔布与5fu联合进行药物干预，证实塞来昔布及5fu各有其独立的抗肿瘤作用，均可作为独立的促凋亡信号诱导肿瘤细胞凋亡，两药联合应用时具有协同抗肿瘤作用，初步阐明了其作用机制可能与显著上调细胞色素c、caspase3及caspase9蛋白表达、激活细胞色素c依赖性凋亡信号通路有关。
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