【摘要】 目的 探讨环氧化酶2(cox2)选择性抑制剂塞来昔布(celecoxib)对前列腺癌细胞株pc3 中vegfc mrna及bcl2 mrna表达的影响,研究cox2抑制剂抗肿瘤的作用机制。方法 将培养的pc3细胞分为四组：试验组(分别以10μmol/l、20μmol/l、40μmol/l不同浓度塞来昔布处理)和对照组，采用rtpcr的方法检测四组中vegfc及bcl2 mrna的表达。结果 10μmol/l塞来昔布组vegfc/gapdh值及bcl2/gapdh值与对照组相比差别均无统计学意义(p＞0.05)；20μmol/l及40μmol/l塞来昔布组vegfc/gapdh值分别为0.370±0.063、0.263±0.062，bcl2/gapdh值分别为0.339±0.047、0.272±0.042，两组中上述两项指标均较对照组明显下降(p均＜0.01）。结论 塞来昔布可能通过对前列腺癌细胞株pc3中vegfc及bcl2 mrna表达的抑制发挥其抗肿瘤作用。
【关键词】 前列腺癌 塞来昔布 血管内皮生长因 bcl2
研究表明，环氧化酶2（cox2）在前列腺癌组织中表达增强[1，2]。体外实验证实cox2抑制剂具有抑制前列腺癌细胞生长的作用[3,4]，但其抗肿瘤的机制尚不完全明确。本实验采用rtpcr的方法对前列腺癌细胞株pc3中的vegfc及bcl2 mrna进行检测，进而探讨cox2选择性抑制剂塞来昔布(celecoxib)的抗癌机制。WwW.11665.cOM
1 材料与方法
1.1 细胞株
人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株pc3,由青岛大学医学院病理生理教研室惠赠。
1.2 主要试剂
选择性cox2抑制剂塞来昔布购自普强苏州制药有限公司。rpmi 1640培养液、小牛血清均购自青岛海泰生物技术有限公司；总rna提取试剂盒，cdna合成试剂盒及pcr扩增试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.3 细胞培养及实验分组
将塞来昔布加入适量的0.01mol/l pbs(ph7.4)中配制成5.6mg/l母液，高压灭菌于4℃保存，使用时用培养液稀释成所需浓度；在含10%小牛血清的rpmi1640细胞培养基中加青霉素及链霉素各100u/ml，将pc3细胞接种于配好的培养基中，在37℃、5%co2及95%饱和湿度条件下培养，每3～5天传代。取对数生长期的前列腺癌细胞进行实验，用质量分数0.25%的胰蛋白酶消化,加培养液制成5×105/ml细胞悬液，接种于96孔培养板，200μl/孔,待细胞贴壁后去上清，试验组分别加入含10、20、40μmol/l三种不同浓度的塞来昔布培养液,每一浓度设10个重复孔，对照组仅加入含10 %小牛血清的rpmi 1640培养液。继续培养72h后收集细胞，进行总rna提取及rtpcr检测。
1.4 引物的设计与合成
采用primer5.0软件设计相关基因引物序列。bcl2的引物序列为：上游引物5′gtg gtg gag gag ctc ttc ag3′，下游引物5′tcc aca aag gca tcc ca g3′，产物片段长203bp；vegfc上下游的引物序列分别为：5′aat gtg ggg cca acc gag aa3′，5′cca ata tga agg gac aca acg3′，扩增长度为259bp；内对照3磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)上下游引物分别为：5′ggt gaa ggt cgg agt caa cgg3′，5′ggt gat gag tcc ttc cac gat3′，扩增长度为425bp。以上引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。
1.5 总rna 提取及rtpcr
采用trizol一步法提取总rna。紫外分光光度计测样品a260和a280值, 琼脂糖凝胶电泳鉴定rna质量，其余-80℃保存。按逆转录试剂盒说明书操作反转录合成cdna，产物-20℃保存。取反转录产物5μl进行pcr扩增，反应体系为50μl，包括10×buffer 5μl，25mmol/l mgcl23μl，10mmol/l dntp 1μl，上下游引物各2.5μl，cdna模板5μl，taq酶1μl，ddh2o 30μl。vegfc的反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸40s，共35个循环，最后72℃延伸10min；bcl2的反应条件：94℃预变性2min后，94℃45s，50℃退火40s，72℃60s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min；gapdh作为内参照基因与目的基因一一对应同时进行pcr反应，以达定量目的。pcr 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳eb染色观察结果。以平均吸光度×条带面积表示总的吸光度，以此代表mrna 的量。凝胶图像分析系统以vegfc和bcl2基因与内参照基因（gapdh）电泳带的吸光度比值作为vegfc和bcl2 mrna的表达量指标。
1.6 统计学方法
采用spss12.0统计软件进行单因素方差分析和两两比较q检验，数据均用±s表示。
2 结果
前列腺癌细胞pc3中vegfc及bcl2 mrna表达的pcr产物凝胶电泳结果见图1、2。在三个处理组中，20μmol/l、40μmol/l塞来昔布组vegfc和bcl2mrna表达量均降低，尤以40μmol/l组降低明显。凝胶图像分析系统分析结果经统计软件处理，对照组与各处理组中vegfc/gapdh及bcl2/gapdh的值见表1、2。表明在一定浓度范围内，塞来昔布对pc3细胞株中vegfc及bcl2 mrna的表达有抑制作用。表1 vegfc mrna在pc3中的表达 表2 bcl2 mrna在pc3中的表达
3 讨论
环氧化酶是前列腺素合成过程中的限速酶，有cox1、cox2和cox3三种。自上世纪90年代cox2抑制剂的抗肿瘤作用日益受到人们重视，动物实验也已证明选择性cox2抑制剂可对肿瘤产生显著治疗作用［5］。cox2抑制剂防治肿瘤的机制可能是通过抑制cox2进而抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡。塞来昔布是近年来开发的新型非甾体类抗炎药,其抗肿瘤作用已有报道［6］,但其作用机制尚不完全清楚。据此，我们选择了vegfc和bcl2作为研究对象探讨cox2抑制剂抗肿瘤的作用机制。
肿瘤的生长、浸润和转移是血管生成依赖性的，当肿瘤＞0.4mm3时，为保证其快速增殖，必须有血管生成［7］。提示血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor，vegf)与恶性肿瘤的发生及生长有一定关系。vegfc是vegf家族成员之一，有较强的促进新生血管和淋巴管形成作用，参与病理性、生理性淋巴管和血管新生。已有实验表明，前列腺癌组织vegfc mrna的表达，促进了肿瘤诱导的淋巴管新生，在前列腺癌的淋巴转移中发挥了重要作用［8］。cheng等［9］对肝癌组织中cox2 、vegf、前列腺素( pg) 以及肿瘤微血管密度(mvd) 的状况进行了检测, 发现cox2 和vegf 在肝细胞癌中的表达均有增高 ,且cox2 与vegf及mvd有关(p=0.003和p=0.004)。在某些消化道肿瘤中cox2表达与vegf呈正相关，提示cox2可能通过诱导vegf表达上调促进肿瘤生长［10］。
bcl2基因是从滤泡性淋巴细胞中分离出来的一种癌基因。在多种肿瘤中表达，具有抑制肿瘤细胞凋亡的作用［11］。bcl2基因的过度表达并不影响细胞增殖和加速细胞分裂，而是阻止细胞凋亡的发生，延长肿瘤细胞生存时间［12］。在对某些皮肤肿瘤的研究中发现，bcl2 的表达与cox 2 的过表达有关，cox2 可能是通过激活bcl2 发挥抗凋亡作用而促进皮肤肿瘤形成及发展。
本实验证实了一定浓度的塞来昔布对前列腺癌细胞株pc3中vegfc及bcl2 mrna的表达有抑制作用，表明cox2抑制剂可能通过对前列腺癌细胞中vegfc和bcl2基因表达的抑制来发挥其抗肿瘤作用。这为临床上治疗前列腺癌，特别是非激素依赖型前列腺癌提供了新的方法。
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