【关键词】 原发性肝癌 卵圆细胞 物学特征 肝癌发生
卵圆细胞最初是在1944年由opie等[1]在大鼠化学诱癌的过程中发现的。1956年，farber[2]首次将其命名为卵圆细胞。关于肝癌的发生，主要有两种不同的学说：一种认为肝癌是由分化成熟的肝细胞去分化而成，这是关于肝癌发生的比较经典的理论[3]；另一种学说认为肝癌是由肝内的干细胞——卵圆细胞异常分化所致；其代表人物sell s等[4]根据卵圆细胞的形态、表型特征、癌基因表达等大量间接证据，认为肝细胞癌来源于卵圆细胞。由于卵圆细胞是一个异质性的细胞群，对其生物学特性还没有一个公认的结论，这样就导致分离、提纯卵圆细胞还缺乏一个公认的标准。卵圆细胞的可能来源、卵圆细胞与肝癌发生之间的关系等依然是学术界争论的问题。正是基于以上存在的问题，我们设计了本实验，试图通过动态的方法观察卵圆细胞的生物学特征及其可能的来源，并为肝癌发生的干细胞异常分化学说提供一个实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物模型的构建及标本处理
选取的sd雄性大鼠和标准饲料由中山大学北校区实验动物中心提供，诱癌饲料由标准饲料加入0.06％3′甲基4二甲氨基偶氮苯（3′methyl4dimethylaminoazobenzene, 3′medab）(东京化成工业株式会社)制成。Www.11665.CoM29只sd大鼠分为2个实验组：诱癌组大鼠24只，喂饲诱癌饲料和正常饮水；对照组大鼠5只则喂饲标准饲料和正常饮水。各组大鼠分别在诱癌后第4、8、14、17和24周处死（诱癌组第4周时处死4只，其后分4次各处死5只；对照组每次处死1只），取肝组织经4％甲醛固定，石蜡包埋并连续切片备用。
1.2 常规he染色和免疫组化(immunohistochemistry,ihc)
he染色按照实验室常规方法进行。
1.2.1 免疫组化所选用的一抗、试剂盒及操作方法。
ov6单抗，由美国stewart sell教授惠赠。抗体稀释度为1∶50，用edta高压修复，所用二步法试剂盒及dab显色剂均购自福州迈新公司。afp（克隆号a0008）和ckit（克隆号a4502）均购自dako公司，前者抗体稀释度为1∶100，用柠檬酸热修复；后者抗体稀释度为1∶50，用edta高压修复；所用sp法试剂盒及dab显色剂均购自福州迈新公司。上述3种免疫组化均按照说明书进行操作。
1.2.2 免疫组化对照组的选择
每组切片均设立阴性空白对照、阳性对照、阴性对照。阴性空白对照片用pbs代替一抗，其余方法步骤一样；阳性对照片是已知的肯定有表达的切片；阴性对照片是肯定没有表达的切片。
1.3 特殊染色
爱先蓝（alcian blue,ab）（ph2.5）法[5]，按参考文献[5]方法操作。粘液物质呈蓝色阳性反应，阴性反应的组织、细胞呈红色。
2 结果
2.1 实验性肝癌发生过程的he形态学特点
随着诱癌剂刺激时间的延长，卵圆细胞增生越来越明显：从第4周开始汇管区有少量的卵圆细胞增生。第8周时卵圆细胞较前增多，沿着肝小叶界板增生，同时向肝实质以出芽状延伸。还可见胆管增生灶和胆管不典型增生灶、肝细胞透明变、嗜酸性变和小细胞变病灶，以上病变统称为肝癌前病变[6，7]。第14周时卵圆细胞明显增多，并分割肝小叶呈假小叶状；肝细胞癌前病变较前明显，病灶有形成结节的趋势，见图1；部分区域胆管不典型增生灶恶变。第17周时卵圆细胞增生较前未增加，部分区域形成明显的肝内胆管细胞癌灶并沿汇管区浸润生长，逐渐融合成连续的较大片的癌灶，见图2。第24周时，大片分布的癌灶周边可见少量残存的相对正常的肝组织，卵圆细胞很少见；癌灶呈梁索型、假腺样型或不规则腺样、管状结构，见图3。
正常对照组从第4周到第24周均未见卵圆细胞增生，保持正常肝组织的结构。
2.2 爱先蓝染色
诱癌第24周大片癌灶中，梁索型、假腺样型区爱先蓝染色阴性，证实其为肝细胞癌灶；而不规则腺样、管状结构区阳性，证实其为肝内胆管细胞癌灶[8] ，见图4。还有的癌灶，呈粗梁索型，但其中有少数胞浆蓝染的细胞，与阴性染色的细胞相间混杂。正常肝细胞、胆管、卵圆细胞爱先蓝染色均阴性。以上特点说明本诱癌模型最后发生的是一种混合性肝癌。
2.3 免疫组化
2.3.1 ov6表达特征
ov－6阳性呈棕黄色细颗粒状，分布于胞浆中。卵圆细胞，见图5、6，胆管上皮细胞和胆管细胞癌灶均呈阳性，而肝细胞、肝细胞癌灶阴性。正常对照组从第4周到第24周均未见卵圆细胞增生，在汇管区可见正常的胆管细胞ov－6阳性。阴性空白对照背景洁净。
2.3.2 afp表达特征
afp在卵圆细胞和胆管细胞癌灶中弱阳性，而胆管细胞和肝细胞阴性。诱癌第24周时，在大片的癌灶中，梁索型、假腺样型的肝细胞癌灶afp阳性表达,部分区域强阳性，见图7，而不规则腺样、管状结构的胆管细胞癌灶呈阴性。正常对照组均未见afp阳性表达的细胞。阴性空白对照背景洁净。
2.3.3 ckit表达特征
ckit在卵圆细胞和胆管细胞癌灶呈弱阳性；正常肝组织中枯否细胞阳性，而肝细胞和胆管细胞阴性。诱癌第8周时，汇管区ckit弱阳性的卵圆细胞增生明显，细胞密集的区域有少数散在的ckit强阳性（但ov6阴性）细胞，至第14周时这种细胞数量增多，见图8。诱癌第24周时，大片癌灶无ckit表达。正常对照组均未见卵圆细胞增生，正常肝组织中可见阳性表达的枯否细胞。阴性空白对照背景洁净。
3 讨论
实验性肝癌动物模型具有人体标本不可替代的作用。它可以模拟肝癌发生的自然进程，具有很好的可控制性和可重复性。3′甲基4二甲基氨基偶氮苯（简称3′medab）因其诱癌效果好、癌变过程阶段性明显而成为使用最为广泛的诱癌剂之一[9]。
ov6是美国休斯顿大学于1989年[10]制备的单克隆抗体，因其对卵圆细胞特异性强而作为一种示踪标志。第14周以前，在诱癌剂的持续作用下，卵圆细胞的增生随着诱癌持续时间的延长而加重。但第14周以后，增生的卵圆细胞一部分向胆管细胞和肝细胞分化以修复受损的肝脏，另一部分却在诱癌剂作用下发生恶性转化，形成混合性肝癌。实验性肝癌模型很好的说明了从卵圆细胞开始增生，然后经过肝癌的癌前病变[6,7]到混合性肝癌发生的过程。ov－6阳性细胞在肝癌发生过程中的分布特征与he切片中观察到的卵圆细胞的演变特征相吻合，从一个新的角度说明了卵圆细胞与肝癌发生之间有密切的关系。
本动物模型所诱导的胆管细胞癌，根据其he形态特点，判断为细胆管细胞癌，是一种发生于细胆管或赫令管的特殊类型的胆管细胞性肝癌[11]。由于肝脏在持续的诱癌剂的作用下，从卵圆细胞增生到胆管细胞癌变的进展很快（在诱癌的第14周开始即有胆管细胞癌的形成，到第24周才有明确的肝细胞癌灶形成），癌细胞依然保留ov－6这种卵圆细胞的分子标记，这也很好的证明了胆管细胞癌起源于卵圆细胞。
我们的动物模型中从第 8周就出现卵圆细胞由汇管区开始沿着肝界板增生的现象，与赫令管的组织结构特点相吻合，证实卵圆细胞可能来源于赫令管上皮的增生，与大多数的文献报道一致[12]。正是因为这一点，所以卵圆细胞与胆管上皮细胞共表达ov6也不足为奇了。也由于卵圆细胞来源于赫令管上皮这一事实，在诱癌剂的持续作用下，被激活的赫令管上皮细胞容易发生基因突变，形成细胆管细胞癌。而来源于赫令管上皮的干细胞要经过不同分化阶段的卵圆细胞，然后经小肝细胞再分化成肝细胞，分化的路线较长，所以发生肝细胞癌的时间要明显滞后一些[1,13]。肝癌发生机制的复杂性决定了我们的诱癌模型肝癌形态结构的复杂性。
afp，即甲胎蛋白，是一种幼稚肝细胞的标记，卵圆细胞表达afp与文献报道一致[14]，说明卵圆细胞具有幼稚肝细胞的特性，具有向肝细胞分化的潜能。 一般认为afp也是肝细胞癌的一种特异性很强而敏感性较低的标志物[15]，本模型混合性肝癌中肝细胞癌灶阳性表达，证实了其肝细胞源性；但胆管细胞癌灶也有afp的弱表达，这是由于从卵圆细胞增生到胆管细胞癌变的进展很快，癌细胞依然保留卵圆细胞的分子标记，所以即使是胆管细胞癌，也可以表达较弱的afp。
ckit又称cd117，是干细胞因子（stem cell factor）的受体，是骨髓干细胞的标志之一[16]。卵圆细胞表达较弱的ckit，说明卵圆细胞与骨髓源干细胞之间有某种渊源联系[16]。在胎儿早期，肝脏曾经是一个造血器官；在胎儿后期，造血干细胞由肝脏向骨髓迁移的过程中，可能仍然有部分残留在肝脏，并可能是卵圆细胞的前体细胞，所以卵圆细胞与骨髓源干细胞具有相同的分子标记。除了存在于肝内的固有来源外，还有可能持续、严重的肝损伤释放某种信号分子，刺激、吸引骨髓干细胞向肝脏移行，到达肝脏后肝损伤局部的微环境（niche）可以刺激某些基因的表达，使之朝卵圆细胞方向分化，并进而向肝细胞或胆管上皮细胞分化，以期调动机体的所有潜能来修复肝脏损伤[17，18]；随着卵圆细胞的继续分化，其骨髓源性干细胞的标记逐渐减弱，到第24周发生混合性肝癌时，已经发生恶性转化的干细胞丢失骨髓源干细胞的标记，因而ckit在癌灶中未见表达。
综上所述，我们得出以下结论：卵圆细胞是一种肝内干细胞，具有双向分化的潜能，在诱癌剂的持续作用下，可异常分化形成混合型肝癌；特征性表达ov6、afp和ckit，其中ov6是卵圆细胞最特异的分子标志；ckit在实验性肝癌中的表达特征说明了卵圆细胞与骨髓干细胞之间可能存在某种渊源联系，这一点还有待我们进一步的研究以找到更直接的证据。
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