【摘要】 目的 探讨选择性环氧化酶2抑制剂塞来昔布对膀胱肿瘤的抑制作用及其机制。方法 建立小鼠膀胱肿瘤模型并随机分为对照组、实验1组和实验2组，分别给予生理盐水和不同剂量的塞来昔布灌胃，观察肿瘤的生长情况，测量肿瘤体积、质量并计算抑瘤率；免疫组织化学方法检测肿瘤原癌基因bcl2和半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶3（caspase3）的表达情况，并计算其免疫组化评分（his）。结果 实验1、2组肿瘤的平均质量明显低于对照组，差异有显著性（f=64.99,q=4.52、15.66,p<0.05）。实验1、2组的抑瘤率分别为43%和58%。3组间bcl2的his比较差异有显著性（f=25.08,q=3.75～9.91,p<0.05）；3组间caspase3的his比较差异有显著性（f=16.82,q=3.26～8.15,p<0.05）。结论 塞来昔布能抑制小鼠膀胱肿瘤的生长，其机制可能与抑制bcl2、增强caspase3的表达有关。
【关键词】 膀胱肿瘤 塞来昔布 基因,bcl2 半胱氨酸内肽酶类
inhibitory action of celecoxib on bladder cancer in mice
li ziheng, liu yong, jing tao
(department of urology, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china);
［abstract］ objective to investigate the depressant effect of celecoxib, a cyclooxygenase2 inhibitor, on the growth ofurinary bladder cancer in mice. methods a model of bladder tumor in mice was created and randomized to control group, experiment groups ⅰ and ⅱ. an intragastric administration of normal saline and different doses of celecoxib was given to different groups. the growth of tumor was observed, the gross tumor volume and weight measured, and tumorinhibiting rate calculated. the expressions of bcl2 and caspase3 proteins were examined immunohistochemically and immunohistochemical scores calculated. results the average volume and weight of tumors in experiment groups ⅰ and ⅱ were significantly lower than those of the control group (f=64.99;q=4.52,15.66;p<0.05), the inhibition rate of the two groups was 43% and 58%, respectively. the differences in the scores of bcl2 expressions among the experiment groups ⅰ, ⅱ and the control group were significant (f=25.08;q=3.75-9.91;p<0.05), and that of caspase3 among the three groups were also significant (f=16.82;q=3.26-8.15;p<0.05). conclusion celecoxib can suppress the growth of bladder tumor in rats, its mechanism might be associated with decreasing the expression of bcl2, and increasing that of caspase3.
［key words］ bladder neoplasms; celecoxib; genes, bcl2; cysteine endopeptidases
近来有研究表明，环氧化酶2(cox2)能在炎症因子、肿瘤因子的诱导下迅速合成，并参与肿瘤的形成，而其抑制剂很有可能有抑制肿瘤生长的作用。WWW.11665.cOm本实验通过建立小鼠膀胱肿瘤模型，观察在cox2抑制剂塞来昔布的干预下肿瘤的生长情况，探讨其抑瘤作用机制。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
小鼠膀胱癌细胞btt739由青岛大学医学院生理学实验室馈赠，培养于dmem培养液(含有体积分数0.10胎牛血清，10×104 u/l 青霉素，10×104 u/l链霉素)中，置于含体积分数0.05 co2的37 ℃孵箱中扩增，每2～3 d换液传代；选择t739小鼠26只，4～8周龄，体质量为15～30 g，雌雄兼有，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司；兔抗小鼠bcl2、casapse3单克隆抗体，购于武汉博士德生物工程有限公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠igg抗体，购自华美生物工程公司；塞来昔布由辉瑞公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 模型的建立、分组与处理
取对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化，收集细胞制成悬浊液，调至细胞密度2×1010/l。26只小鼠，每只在右侧颈背部皮下接种0.1 ml悬浊液，约1周后可扪及皮下肿瘤，待肿瘤直径长至平均约4 mm时，去除肿瘤体积较小的2只小鼠，将小鼠随机分成对照组、实验1组和实验2组。实验1、2组分别给予塞来昔布30、60 mg/（kg·d）灌胃给药，对照组同法给予等量生理盐水。定期观察小鼠精神、饮食、排便情况。从给药的当天开始每隔5 d，测量肿瘤长径（a）、短径（b），按公式v=ab2/2估算肿瘤的体积[1]。绘制肿瘤生长曲线比较肿瘤生长的差异。35 d后杀死全部小鼠并切除肿瘤，称质量并计算抑瘤率。抑瘤率=(1-实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100%。常规苏木精伊红（he）染色，光镜下观察肿瘤形态学变化，并留用标本进一步做免疫组化学检测。
1.2.2 免疫组化学染色方法及结果判定标准
免疫组化学染色采用sp法，一抗为bcl2、caspase3兔抗鼠单克隆抗体；二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠igg抗体。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。用pbs液代替一抗做阴性对照；用既有的阳性标本做阳性对照。判断标准：bcl2、caspase3均表达于细胞质，细胞染成淡黄色至棕黄色为阳性细胞，每张切片观察5个高倍视野（400倍），计数100个肿瘤细胞中阳性染色的细胞数，计算该切片阳性率平均值。结合阳性率与阳性细胞染色强弱2个方面评分。a为阳性率：无阳性细胞=0；阳性细胞占1%～10%=1；阳性细胞占11%～50%=2；阳性细胞占51%～80%=3；阳性细胞占81%～100%=4。b为阳性细胞染色强弱：阴性=0；弱阳性=1；中度阳性=2；强阳性=3。a、b两项的乘积即为其免疫组化评分 (his)[2]。
1.2.3 统计学处理
所有数据以±s表示，采用spss 13.0及ppms 1.5[3]统计软件进行统计分析。
2 结果
2.1 成瘤及小鼠生长情况
24只小鼠均种植肿瘤成功，成瘤率为100%，实验中可看到，随着肿瘤的增大小鼠逐渐消瘦并活动减少，但小鼠的体质量实验前后并没有明显的差异。
2.2 塞来昔布对小鼠肿瘤生长的影响
对照组、实验1组、实验2组肿瘤的平均质量分别为（5.21±0.26）、（3.04±0.37）、(2.16±0.84)g，实验1、2组肿瘤的平均质量明显低于对照组，差异有显著性（f=64.99,q=4.52、15.66,p<0.05）。实验1、2组的抑瘤率分别为43%、58%。
2.3 塞来昔布对肿瘤bcl2、caspase3表达的影响
3组间bcl2的his比较差异有显著意义（f=25.08,q=3.75～9.91,p<0.05）；3组间caspase3的his比较差异有显著性（f=16.82,q=3.26～8.15,p<0.05）。随着bcl2 表达的降低而caspase3表达增强，两者之间呈负相关性（r=－0.604，p<0.05）。见表1。表1 各组bcl2与caspase3的his比较(略)
3 讨论
研究表明，环氧化酶抑制剂能抑制肿瘤的生长，可大大降低结直肠癌的发病率和病死率，并且美国fda已批准的对家族性结肠息肉性腺瘤进行的人体试验取得了令人满意的结果[4]。rubbs等[5]的研究亦表明，塞来昔布可以降低膀胱癌的发生率以及延长大鼠的存活时间。但李春等[5]研究显示，塞来昔布并不能阻止癌前病变的发生，而是阻止癌前病变的恶化，这与crubbs等[5]的研究结论一致。已有动物实验证明，塞来昔布不仅能阻止肿瘤的产生，而且对已经形成的肿瘤也有明显的促萎缩的作用，该作用的大小与塞来昔布的剂量呈正相关[56]。本实验结果也表明，塞来昔布能明显抑制膀胱肿瘤的生长，且对肿瘤的抑制呈明显的剂量依赖性。
目前，对塞来昔布抑瘤作用机制的研究认为，无论是选择性cox2抑制剂，还是非选择性cox2抑制剂都能抑制体外肿瘤细胞生长和裸鼠体内肿瘤的形成。文献报道，对于非甾体抗炎药的抗肿瘤作用可分为cox2依赖途径和非cox2依赖途径[7]，其中cox2依赖途径主要通过抑制cox2的表达、降低pgs水平而起到抑制肿瘤生长的作用。非甾体抗炎药也可通过非cox2依赖途径抑制nfκb与激活因子ⅰ活性，从而影响凋亡基因的表达[8]。
本实验主要探讨塞来昔布非cox2依赖途径的抗肿瘤机制。细胞凋亡是受基因调控的，有众多基因参与凋亡过程，其中bcl2和caspase3被认为具有重要的调节作用。bc12是主要的抗凋亡和促凋亡成员，它通过调节线粒体的功能来调节细胞凋亡；caspase3为凋亡的效应分子，是凋亡途径下游进行底物酶解的关键蛋白酶，被称为凋亡的“执行者”[9]。本实验结果显示，塞来昔布抑制膀胱肿瘤生长过程中, bcl2 蛋白表达下降,且呈剂量依赖性。提示塞来昔布下调bcl2 表达在抑制膀胱肿瘤生长中起重要作用，但其具体的分子机制仍不清楚。
本实验结果还显示，塞来昔布在降低bcl2 表达的同时, 上调了caspase3 表达。其可能的机制为：bcl2 基因蛋白能够减低细胞色素c和凋亡诱导因子(aif) 如caspase3从线粒体释放入细胞质, 对细胞凋亡起抑制作用。同时，bcl2还可以直接将胞浆中与caspase3 结合的apaf1结合于线粒体膜，形成四聚体复合物，使apaf1 失去对caspase3酶的活化能力[10]。
总之，本实验结果显示，塞来昔布抑制了小鼠膀胱种植肿瘤的生长，其中bcl2、caspase3与之密切相关，塞来昔布抑制并下调bcl2表达的同时，活化caspase3的表达，推测这可能是其抑制肿瘤生长的机制之一。该实验也为寻找新的膀胱肿瘤化疗药物提供了新的方向。
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