【摘要】 目的 选择性cox2抑制剂celecoxib对放射引起的dna损伤修复的影响。方法 流式细胞仪subg1法检测凋亡率和细胞周期；单细胞凝胶电泳技术检测dna的损伤及修复。rtpcr和western blot检测dna修复基因ku70、ku80的表达。结果 celecoxib对 hela细胞的周期分布无明显改变，但可引起剂量依赖性凋亡。celecoxib可明显提高放射引起的凋亡率，剂量增强比（def）在60、80、100μmol/l时分别为3.18、4.16、6.96。同时celecoxib对6gy x线引起的g2/m期阻滞有明显的减弱作用（放射组：g2/m 32.35%，药放组：g2/m 5.95%）；celecoxib 不明显增加放射引起的dna损伤，但可明显延缓放射引起的ssb和dsb的修复（p<0.05）；celecoxib明显抑制hela细胞ku70、ku80的表达（p<0.05）。结论 cox2 选择性抑制剂celecoxib对肿瘤细胞的放射增敏机制可能与抑制dna损伤修复有关，其作用可能通过减弱辐射诱导的g2/m期阻滞和抑制dsb重组修复酶dnapk成分ku的表达得以实现。
【关键词】 celecoxib；hela细胞；放射增敏机制；细胞周期；dna损伤修复
effects of selective cox2 inhibitor on dna repairing after irradiation
xu huiting, yu shiying, xia shu,xiong hua，zhuang liang
cancer center, tongji hospital, tongji medical college, huazhong university of science and technology, wuhan 430030, china
corresponding author: yu shiying,email：[email protected]：objective to investigate the effects of a selective cox2 inhibitorcelecoxib on dna repairing after xrays irradiation，in order to elucidate the possible mechanism of the radiosensitization of selective cox2 inhibitor.methods human cervical carcinoma cells (hela) were cultured in vitro and exposed to different doses of celecoxib for 48h then with and without radiation（6gy）, flow cytometry subg1fluorescence parameter line was performed to analyze the change of the apoptosis and cell cycle distribution.the dna damage and repair were detected by single cell gel electrophoresis assay.semiquantitative rtpcr and western blot were used to measure the mrna and protein level of ku70 and ku80 in hela cell lines treated with celecoxib.results celecoxib had no effect on the cell cycle distribution of hela cell lines,but it induced apoptosis increasing dependent on celecocib doses.radiationinduced apoptosis was enhanced after hela cells treated with celecoxib (enhancement factor=6.96 at100μmol/l), and the radiationinduced g2/m arrest was markedly decreased by celecoxib〔radiation group(rt): g2/m 32.35%, 100μmol/l celecoxib+rt: g2/m 5.95%〕. the dna damage induced by radiation was not increased,but the dna repair was reduced in hela cells treated with celecoxib (60μmol/l) for 48h, the mrna and protein level of ku70 and ku80 were also significantly decreased( p<0.05). conclusion the results suggest that the possible mechanism of radiosensitization of a selective cox2 inhibitor was related to inhibition of dna repair including reduced g2/m arrest cells and decreased dnapk expression.
key words：cyclooxygenase2; celecoxib; g2m phase; dna repair; radiation damage
环氧化酶（cyclooxygenase，cox）是花生四烯酸生物合成前列腺素(prostaglandin,pg)的限速酶, cox分为cox1型和cox2型。www.11665.CoM多数恶性肿瘤呈cox2过度表达，且其表达水平与肿瘤的发生、发展、预后与转移有密切的关系。选择性cox2抑制剂不仅具有抗肿瘤活性，在体内外试验[1]和临床试验[2]中还证实其对肿瘤具有放射增敏效应。但其放射增敏机制还不是很清楚，可能与降低pge2水平、促进凋亡、改变细胞周期、抑制dna损伤的修复、抑制血管生成等有关。本文采用人宫颈腺癌hela细胞株，观察选择性cox2抑制剂celecoxib对放射引起的dna损伤修复的影响，旨在进一步阐明选择性cox2抑制剂的放射增敏机制。1 材料与方法
1.1 材料与仪器
宫颈癌hela细胞系由华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤中心实验室冷藏；celecoxib药粉购自安徽森瑞有限公司；碘化丙啶(pi)、 rna酶a(rnase a)购自sigma公司；正常熔点、低熔点琼脂糖（nma，lma）购自gibco公司；rtpcr主要试剂trizol购自上海华舜生物工程有限公司，逆转录试剂盒、taqdna polymerase、dntp mix均系美国fermentas公司产品，dna修复基因ku70、ku80引物由上海赛百胜公司合成；鼠源性单克隆抗体ku70、ku80购自neomarkers公司；fac sort 流式细胞仪(美国becton dickson 公司)。
1.2 细胞培养及处理
对数生长期hela细胞，0.25%胰酶消化分离，常规传代培养于rpmi1640完全培养液中37℃、5%co2培养箱中培养。细胞分为空白组、给药组（celecoxib作用48h）、放射组(6mv x线 6gy) 、药放组（celecoxib作用48h后给予6mv x线 6gy），其中celecoxib再按浓度梯度分为20、40、60、80、100μmol/l组。
1.3 流式细胞仪subg1法检测细胞周期分布及凋亡率
按每孔105个细胞接种于6孔板，待24h后给予不同浓度的celecoxib, 使其终浓度分别为20、40、60、80、100μmol/l，空白组加同等体积的dmso，培养48h后收获细胞并以80%冰乙醇固定，20℃固定过夜。同上另设6个浓度组celecoxib作用48h后予6mv x线6gy照射处理，继续培养24h后收获固定细胞。固定后细胞用pbs洗涤2次,100μl pc缓冲液冰上孵育30min。pbs 洗涤细胞,加10mg/ lpi10μl、50mg/mlrnasea10μl 、pbs500μl室温、暗处进行dna 染色20min。应用流式细胞仪经488nm 激光激发进行检测，应用cellquest 软件(美国becton dickson公司)分析结果。
1.4 单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis assay,scge）检测dna损伤
4组细胞（celecoxib只取60μmol/l组）每组均设平行对照组。将各组细胞消化制备成pbs单细胞悬液（5×105个/ml），并在处理后分别于0、15min、30min、1h、2h时间点收取细胞悬液置冰上。碱性单细胞凝胶电泳法检测dna单链断裂(ssb)：参照singh np [3]的方法，略修改。将上述各时间点收取的细胞在30min内铺入附着于载玻片上的琼脂糖胶内，4℃15min使胶完全凝固。后将胶板浸在碱性细胞裂解液中（2.5m nacl、0.1m edta、1%tritox100、10%dmso）4℃避光作用2h或过夜；将裂解处理后的载玻片用蒸馏水清洗2次，置于解旋液（0.3mol/l naoh）中，4℃避光静置20min。随后将玻片移至盛有新鲜冰冷电泳缓冲液的水平电泳槽中25v，300ma电泳25min。停止电泳后将载玻片转移至中和缓冲液中10min，蒸馏水柔和冲洗2～3遍，略干后滴加浓度为20μg/ml的溴化乙啶50μl/片，盖上盖玻片放在湿盒中，２天内拍照保存。中性单细胞凝胶电泳法检测dna双链断裂（dsb）：制胶同碱性单细胞凝胶电泳法。将制好的胶板置入新配的中性裂解液(2mol pl nacl、30mmol/l edta、1%十二烷基肌氨酸钠、10mmol/l tris、1%triton x100、10%dmso、ph8.2～8.5)中于4℃裂解2h或过夜；0.5%tbe(2mmol/ledta、90mmol/l tris、90mmol/l 硼酸、ph8.2～8.5)浸没漂洗3次,每次1h；在盛有0.5%tbe电泳缓冲液的水平电泳槽中0.6v/cm ，电泳25min；后同碱性单细胞凝胶电泳法。在荧光显微镜下每样本观察100个细胞，用casp comet assay software project对彗星图像进行分析，计算各组彗星的oliver尾矩（oliver tail moment，otm，即尾部dna百分含量×迁移dna中心密度）。
1.5 半定量rtpcr
分析给药组（60μmol/l celecoxib作用48h）与空白组hela（只给相当dmso）细胞ku80、ku70 mrna的表达。按试剂说明书完成rna抽提纯化和cdna的合成，以逆转录产物为模板进行pcr扩增。
ku70引物为：5′ctctatcgggaaacaaatgaaccag3′25bp（正向），5′gtatctgcacaatgctgcaacctcc3′25bp（反向），退火温度54℃，扩增产物339bp；ku80引物为：5′tatgctcccaccgaggcacagttga3′25bp（正向），5′actgccttcagccagactggagacg3′25bp（反向），退火温度56℃，扩增产物478bp；βactin引物为：5′cctagaagcatttgcggtgg3′，20bp (正向),5′gagctacgagctgcctgacg3′，20bp （反向），退火温度56℃，扩增产物416bp。pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察并拍照。
1.6 western blot检测
按给药组（60μmol/l celecoxib作用48h）与空白组hela（只给相当dmso）提取细胞总蛋白。具体方法如下：冷的pbs溶液洗3遍，适量细胞裂解液（150mmol/l triscl、0.02%叠氮钠、0.1%sds、100μg/ml pmsf、1μg/ml aprotinin、1%np40、0.5%去氧胆酸钠、150mmol/l nacl）裂解提取总蛋白，用10%的分离胶做sdspage，然后转移至nc膜上，5%脱脂奶tbst室温封闭1h，分别加入一抗4℃孵育过夜，tbst洗涤10min×3次，辣根过氧化物酶二抗室温孵育1.5h， tbst洗涤10min，洗3次，ecl曝光试剂盒曝光底片显影。
1.7 统计学方法
以上实验均重复3次，组间和组内采用t检验和方差分析，数据分析由spss11.0软件完成。
2 结果
2.1 celecoxib与射线单独和联合作用后hela细胞周期及凋亡率的变化 单独 celecoxib作用48h后对hela细胞的周期分布无明显改变，但celecoxib可引起hela 细胞发生剂量依赖性的凋亡，见表1。表1 celecoxib对细胞周期和凋亡率的影响
celecoxib+放射组与单纯放射组相比,可明显提高放射引起的凋亡率，在celecoxib浓度为60、80、100μmol/l时，可分别增强放射诱导的凋亡率达3.18、4.16、6.96倍。同时celecoxib对6gy x线引起的g2/m期阻滞有明显的减弱作用，见图1。
2.2 celecoxib与射线联合作用对hela细胞dna损伤的影响
2.2.1 碱性单细胞凝胶电泳法检测hela细胞ssb如表2所示，空白组与加药组的ssb损伤之间差异无统计学意义（p>0.05），表明适当剂量的celecoxib（60μmol/l）并不引起明显的ssb。药放组与放射组相比，其初始ssb（照射后0min时的ssb）无差异（p>0.05），而药放组照射后各时间点的ssb均高于放射组（p<0.05）；并且放射组的ssb于照射后2h基本修复完全（与空白组相比差异无统计学意义，p>0.05），药放组的ssb修复较慢，至照射后2h仍有明显残留的ssb未修复。
2.2.2 中性单细胞凝胶电泳法检测hela细胞dsb 如表3所示，与ssb的检测结果相似，药放组与放射组相比，其初始dsb也无差异（p>0.05）；而药放组与放射组相比，药放组的dsb修复速度明显低于放射组（p<0.05）, 至照射后2h药放组仍有约37％的残留dsb未修复。
2.3 半定量rtpcr方法检测celecoxib对hela细胞ku70，ku80 mrna表达水平的影响
空白组ku70(1.030±0.066)，ku80(1.335±0.082)mrna表达水平明显高于给药组ku70(0.744±0.066)，ku80(0.596±0.024)mrna表达水平（p<0.05），见图2。
2.4 western blot检测celecoxib对hela细胞ku70和ku80蛋白表达的影响表2 碱性单细胞凝胶电泳法检测hela细胞ssb尾距（otm）rt* ：radiation; n=9；rt+celecoxib组与rt*组的0min相比，p>0.05；rt+celecoxib组与rt*组其余时间点相比，p<0.05；celecoxib组与control组相比，p>0.05表3 中性单细胞凝胶电泳法检测hela细胞dsb尾距（otm） 结果显示宫颈癌hela细胞经60μmol/l celecoxib作用48h后，ku70（0.390±0.058），ku80（0.647±0.120）蛋白表达水平均较空白组ku70(0.785±0.113)，ku80(1.232±0.167)（p<0.05）有明显下调，见图3。
3 讨论
目前已有临床研究表明，放射敏感的肿瘤表达的cox2蛋白水平普遍低于放射抗拒的肿瘤，且cox2蛋白的表达水平与肿瘤的放射敏感性呈正相关[4,5]。体内试验和体外试验早已证明，非甾体消炎药（nsaids）如吲哚美辛（indomethacin）或布洛芬（ibuprofen）可提高肿瘤放射效应。近期研究表明选择性cox2抑制剂的放射增敏效应显著高于非选择性cox抑制剂，如在相同的鼠移植瘤模型中，以肿瘤生长延缓(tumor growth delay，gd) 为评价标准，sc236和吲哚美辛的放射增强因子(enhancement factor, ef)分别为3.64和1.39[1,6]。其放射增敏机制可能与抑制cox2的活性，降低细胞内pge2水平；促放射诱导的凋亡；细胞周期改变和抑制dna损伤修复有关。该实验室曾在体内外实验中证实，celecoxib对宫颈癌hela细胞具有放射增敏作用，并在其小鼠移植瘤模型中证实hela细胞具有高cox2表达[7]。该实验研究了选择性cox2抑制剂celecoxib与放疗结合时对宫颈癌hela细胞dna损伤修复的影响。
3.1 细胞周期与放射敏感
处于不同周期的细胞，对低let射线放射敏感性不同，多数实验提示处于m期和g2期的细胞放射敏感性最高。raju等[8]发现用sc236处理nfsa(一种鼠源肉瘤细胞)也可引起g2/m期细胞的累积（67％），同时 cyclin a、b以及cdk1的表达下调。另外，阻滞pg的合成也可能导致g2/m期细胞的堆积。这说明选择性cox2抑制剂的放射增敏机制可能与细胞周期的再分布有关。但petersen等[9]的研究发现，经sc236处理2天，u251的细胞周期没有明显改变。也就是cox2抑制剂诱导细胞周期阻滞与肿瘤细胞类型或其他未知因素有关。该实验也发现单独celecoxib作用于hela细胞不显著影响细胞周期分布，但可使放射引起的g2/m期阻滞作用明显减弱。见图4。与此类似，park等 [10,11]的研究也发现celecoxib可以显著削弱放射引起的cox2阳性表达细胞的g2/m期阻滞，并认为这种作用与celecoxib阻止cdk1、cdk2的磷酸化有关。
真核细胞受照射后，可以广泛诱导g2期阻滞出现，这在保证细胞的完整性、损伤后细胞的存活和保持细胞的遗传稳定性方面具有重要生物学和遗传学意义。哺乳动物细胞预先用咖啡因[12]（可以解除照射诱导的细胞g2期阻滞）处理后照射，可以使细胞存活率明显下降，这说明辐射诱导的细胞g2期阻滞是机体的一种保护性调节。cyclinb1cdc2复合物的活性状态在g2/m期进程调控中起关键作用， 目前普遍认为，atm/atr激酶chk1/chk2cdc25ccdc2是放射诱导g2/m期阻滞的主要途径。但celecoxib如何影响上述途径，使g2/m期阻滞缺失和凋亡促进的分子机制还有待进一步研究。
3.2 dna修复与放射敏感性
dna是电离射线杀伤细胞的主要靶分子，辐射诱导的dna断裂及修复,与细胞内在放射敏感性有很好的相关性,可为细胞内在放射敏感性的预测指标。细胞受到分割的低剂量放射后，少部分细胞呈亚致死性损伤（sld），在细胞存活曲线上出现亚致死性损伤的累积，表现为存活曲线出现肩部及肩区的dp值（即阈值剂量）。raju等[8]发现用sc236（50um,3天）可消除放射存活曲线上的肩区，并通过分割照射（3gy/次，2次间隔4h）证明单纯放射组（1.4）较sc236＋放射组（1.1）有较高的修复能力。
双链断裂(dsb)是辐射所致细胞死亡的最重要的dna损伤形式，它的修复是通过两种形式的重组修复进行的：同源重组（homologous recombination repair，hr）和非同源末端结合重组（nonhomologous end joining, nhej），前者是低等生物修复形式,而高等生物主要是后者。dna依赖的蛋白激酶(dnapk)是参与nhej的重要分子，在dna损伤修复时，首先由其ku亚基结合损伤dna激活dnapkcs后启动dna损伤修复机制。已经证实,一些哺乳动物辐射敏感细胞系不能进行dsb修复的原因是由于dna依赖的蛋白激酶(dnapk)成分ku的缺失。lim等[13]研究发现cox2抑制剂可以下调ku70,ku80这两种dna修复相关基因的表达。md anderson的raju等[14]的实验也不仅在蛋白水平证明celecoxib抑制ku70的表达，同时证明celecoxib还可降低dnaku的结合活性。
综上所述，cox2 选择性抑制剂celecoxib对肿瘤细胞的放射增敏机制可能与抑制dna损伤修复有关，其作用可能通过减弱细胞周期g2/m检测点（checkpoint）作用和减弱dsb重组修复酶dnapk成分ku的表达得以实现。但celecoxib如何影响细胞周期和dna损伤修复的分子机制还有待进一步研究。
【参考文献】
［1］ milas l,kishi k,hunter n,et al.enhancement of tumor response to gamma-radiation by an inhibitor of cyclooxygenase-2 enzyme [j].j natl cancer instit，1999，91(17):15011504.
［2］ park js,jun hj,cho mj,et al.radiosensitivity enhancement by combined treatment of celecoxib and gefitinib on human lung cancer cells [j].clin cancer res，2006，12(16):49894999.
［3］ singh np,mccoy mt,tice rr,et al.a simple technique for quantitation of low levels of dna damage in individual cells[j].exp cell res,1988,175(1):184191.
［4］ nix p,lind m,greenman j,et al.expression of cox2 protein in radioresistant laryngeal cancer [j].annals of oncology,2004,15(5):797801.
［5］ terakado n, shintani s, yano j, et al.overexpression of cyclooxygenase2 is associated with radioresistance in oral squamous cell carcinoma [j].2004,40(4):383389.
［6］ furuta y,hunter n,barkley t jr,et al.increase in radioresponse of murine tumors by treatment with indomethacin[j].cancer res,1988,48(11):30083013.
［7］ 高晓慧，于世英，黄河,等.celecoxib对人癌裸鼠移植瘤的抗癌与放射增敏作用[j].中华放射肿瘤学杂志,2005,14(4):329330.
［8］ raju u,nakata e,yang p,et al.in vitro enhancement of tumor cell radiosensitivity by a selective inhibitor of cyclooxygenase2 enzyme: mechanistic considerations [j].int j radiat oncol biol phys,2002,54(3):886894.
［9］ petersen c,petersen s,milas l,et al.enhancement of intrinsic tumor cell radiosensitivity induced by a selective cyclooxygenase2 inhibitor [j].clin cancer res,2000,6(6):25132520.
［10］shin yk,park js,kim hs,et al.radiosensitivity enhancement by celecoxib,a cyclooxygenase (cox)2 selective inhibitor,via cox2dependent cell cycle regulation on human cancer cells expressing differential cox2 levels[j].cancer res,2005,65(20):95019509.
［11］park js,jun hj,cho mj,et al.radiosensitivity enhancement by combined treatment of celecoxib and gefitinib on human lung cancer cells [j].clin cancer res,2006,12(16):49894999.
