【摘要】 目的 构建抑制大鼠wnt5a基因表达的重组质粒，达到抑制h157细胞wnt5a表达的目的。方法 根据大鼠wnt5a的基因序列，设计合成含有发夹结构的2条寡核苷酸片段，经退火形成双链后克隆至pavu6+27载体质粒中，对阳性重组子进行酶切和测序鉴定后转染正常h157细胞，并采用western blot检测wnt5a蛋白水平表达的变化。结果 重组质粒经双酶切后，有目的条带出现，提示wnt5a干扰片断已克隆至pavu6+27载体质粒中，dna测序结果显示插入序列与预先设计完全一致。重组质粒转染h157细胞后经g418筛选，成功获得阳性克隆，western blot结果显示wnt5a的蛋白水平表达显著下降。结论 成功构建wnt5a基因rna干扰表达质粒，明显抑制h157细胞中wnt5a表达，这为深入研究该基因在非小细胞肺癌发生及侵袭转移中的作用奠定了基础。
【关键词】 wnt5a h157 转染 表达
wnt5a基因是一种与恶性肿瘤转移潜能有关的肿瘤转移相关基因[1,2]，其定位在染色体3p14～p21上。对多种肿瘤组织中wnt5a基因的表达进行分析，发现wnt5a mrna表达与肿瘤转移密切相关。研究发现wnt5a基因表达与多数肿瘤转移成正相关，对肿瘤转移起促进作用，wnt5a的升高预示着肿瘤的淋巴结转移和预后不良。但尚有研究显示wnt5a基因可以作为抑癌基因延缓部分恶性肿瘤的发生发展。WwW.11665.CoMwnt5a基因在不同肿瘤的生物学作用并不一致。为了深入研究该基因在非小细胞肺癌的发生及侵袭转移中的作用，以及阐述其作用机制，我们构建了wnt5a基因rna干扰表达载体，并实现了其对h157 wnt5a基因表达的特异性抑制。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株和质粒 e.coli dh10b为本室保存。质粒pavu6+27为美国密西根大学engelke教授赠送[3]。pavu6+27表达载体全长6 154bp，其多克隆位点含salⅰ和xbaⅰ两酶切位点，该载体含氨苄青霉素抗性基因和g418筛选基因。
1.1.2 干扰序列设计 根据genbank中人wnt5a基因的序列（wnt5a 基因全长5 855bp， cdna clone mgc：71588， image：30346200）在编码区内分别设计了分散于wnt5a基因中不同关键区域的2条 sirna片段（402，403）作为rnai的目的靶序列。
对以上序列进行blast比较，避免与其他基因同源。寡核苷酸的两端分别包含salⅰ和xbaⅰ识别位点的序列，能够直接与经salⅰ和xbaⅰ酶切的载体连接，sirna寡核苷酸由上海生工生物技术有限公司合成（5′端是salⅰ酶切位点，3′端是xbaⅰ酶切位点，见图1）。本实验用限制性内切酶salⅰ和xbaⅰ双酶切pavu6+27质粒，使其线性化，再将退火的干扰片段与线性化质粒pavu6+27连接，得到新的质粒，命名为pavu6siwnt5a。抽提质粒pavu6siwnt5a，经bamhⅰ和hindⅲ酶切，得到一条长约400bp的目的片段。实验参照promega公司和omega公司的操作指南进行。
图1 sirna设计示意图
1.1.3 主要试剂 细胞总dna提取试剂盒购自promega(usa)，脂质体购自roche(usa)，pcr试剂盒购自大连宝生物公司，细胞培养基dmem购自hyclone公司(usa)，抗wnt5a抗体购自santa cruz公司(usa)，各种限制性内切酶购自new england biolabs，电泳试剂均购自sigma，其他试剂为国产分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 寡核苷酸的退火及连接 将合成的寡核苷酸溶于双蒸水，浓度为1μg/μl。各取1μl加入5μl 10×t4dna连接酶缓冲液中，用双蒸水补至50μl。按照下列条件进行退火：
95℃变性5min；95℃～70℃降温0.1℃/s；70℃保温10min；70℃～30℃降温0.2℃/30s。取出退火后的dna，与载体（pavu6+27，sal ⅰ和xba ⅰ酶切）连接、转化感受态大肠杆菌dh10b。
1.2.2 重组质粒的鉴定 挑选转化子，按照试剂盒操作说明进行dna提取，经hind ⅲ和bamh ⅰ酶切后（sal ⅰ和xba ⅰ之间仅有55bp），0.8%琼脂糖电泳鉴定。对初步鉴定的重组子进行序列测定，确定插入片段与预期相同，大量扩增重组质粒用于转染h157细胞。
1.2.3 细胞培养及基因转染 h157细胞由新桥医院肿瘤科陈正堂教授赠送。培养液组成：dmem、10%小牛血清、100u/ml青霉素、50μg/ml链霉素，于37℃、5%co2条件下培养。细胞培养至对数生长期时，收获细胞转接于6孔培养板中孵育24h 后进行转染。采用阳离子脂质体lipofectamine 2000作为转染试剂，将重组质粒和空载体分别转染h157细胞，500μg/ml g418 筛选4周，最终获得转染后的阳性细胞用于下一步实验。
1.2.4 免疫印迹检测 收集转染后阳性细胞，抽提细胞总蛋白，紫外分光仪测蛋白浓度。调整蛋白上样量进行sdspage，聚丙烯酰胺分离胶浓度为12%（30%丙烯酰胺6.00ml，4×tris·cl/sds 3.75ml, h2o 5.25ml , 10%过硫酸铵0.05ml， temed 0.01ml）。蛋白转移时采用半干转印仪(biorad 公司)，15v，30min。一抗稀释浓度为1∶2 500，二抗稀释浓度为1∶5 000。
2 结果
2.1 rna干扰（rna interference，rnai）载体的构建
将退火后的dna与载体连接，转化e.coli dh10b后可见转化子产生。从中随机挑选5个转化子，提取其dna进行酶切。电泳结果显示：有3个阳性克隆产生。将其送至上海生物工程技术服务有限公司进行dna序列测定，wnt5a干扰片断序列和插入的方向与预先设计完全一致。说明克隆成功，重组质粒命名为pavu6siwnt5a，见图2。
2.2 wnt5a 蛋白在h157细胞中的抑制
免疫印迹方法检测转染细胞中wnt5a蛋白的表达，结果显示：重组质粒pavu6siwnt5a（402，403）转染h157细胞后，wnt5a蛋白表达明显降低，见图3。
3 讨论
wnt 基因群[4]是高度保守的信号家族，广泛分布在线虫至人类的众多物种中，它们参与正常的胚胎发生的模式形成和细胞系的分化，以及肿瘤发生。wnt5a基因是wnt家族中的重要成员之一，该基因编码富含半胱氨酸的生长因子，参与生长和分化过程中的细胞间信号传递。人和鼠的wnt5a 蛋白有 99％的同源性。人和非洲爪蟾的wnt5a 蛋白有87％的同源性，鼠和非洲爪蟾的wnt5a cdna均可用于人类细胞的相关研究。
rna干扰[5,6]是近年来发展起来的一种特异性阻抑基因表达的新方法，该技术是近年来发展起来的新的基因沉默技术。作为一个有力工具，已被应用于基因功能研究、基因治疗和新药研究开发等医学领域。它是将与内源mrna编码区同源的小片段（19～23bp）外源双链rna（double stranded rna）导入细胞中，通过一系列细胞内反应引发细胞中相应mrna的降解，从而导致特定基因表达沉默（gene silence）的一种技术。rnai具有高度专一性，能对靶向基因产生特异性强抑制效应，使该基因表达沉默，而对其他基因不产生影响。用rnai技术来抑制靶基因的表达，为治疗寄生虫、病毒感染、癌症、遗传病等疾病开辟了新的研究途径。由于rnai能高效、特异地阻断目的靶基因的表达，已逐渐作为一种代替基因敲除的简单有效工具，在功能基因组学研究、基因治疗等领域越来越受到重视。rna靶序列的1921nt理论上可以在mrna基因的任何位置，因为靶序列只是起导向作用，结合到mrna上以后就可以在各种外切酶的作用下切断mrna，从而降低mrna的稳定性直至最终被完全降解。通常来说，每个目标序列设计3～4对sirna，选择最有效的进行后续研究。本研究针对人wnt5a的mrna编码区设计了2对shrna。
高效和稳定的表达是研究基因功能的前提和基础，载体是基因克隆中外源 dna片段的重要运载工具，选择适当的载体至关重要。此外，转染效率的高低也直接影响插入质粒的表达，高效的转染效率对研究目的基因的细胞学功能也至关重要。脂质体是目前实验研究采取的较为常用的非病毒载体之一，具有转染效率高，细胞毒性低，操作简单的特点。
在构建rna干扰pavu6siwnt5a质粒实验中，我们采用美国密西根大学engelke dr教授赠送的pavu6+27质粒，该质粒全长6 154bp，带有氨苄青霉素和g418的筛选标记，可用于稳定转染细胞的筛选。其带有依赖于rna pol ⅲ 的启动子u6，该启动子具有明确的转录起点和终点，产生的shrna无polya尾，3′为uu，这使得其结构类似于sirna，转录可在终止信号ttttt的第二个t处精确的终止。
由此我们成功构建了针对wnt5a基因的rna干扰质粒 pavu6siwnt5a，经酶切及测序鉴定后成功地用脂质体转染法转染入人肺鳞癌细胞株h157，可明显抑制h157细胞wnt5a的表达，为进一步研究wnt5a基因对肺癌侵袭转移及其生物学行为的影响奠定了基础。
【参考文献】
[1]manabu kurayoshi,naohide oue,hideki yamamoto,et al.expression of wnt5a is correlated with aggressiveness of gastric cancer by stimulating cell migration and invasion[j].cancer res,2006,66(21)：1043910448.
[2]masckauchan tn,agalliu d,vorontchikhina m,et al.wnt5a signaling induces proliferation and survival of endothelial cells in vitro and expression of mmp1 and tie2[j].molecular bio cell,2006,17（12）：51635172.
[3] good pd,krikos aj,li sx,et al.expression of small theupeutic rnas in human cell nuclei[j].gene ther,1997,4(1):4554.
[4] thomas r keeble,michael m halford,clare seaman,et al.the wnt receptor ryk is required for wnt5amediated axon guidance on the contralateral side of the corpus callosum[j].j neurosci,2006,26(21):58405848.
[5] lingx,lif.silencing of antiapoptotic survivin gene by multiple approaches of rna interference technology
