【摘要】 目的 构建防治宫颈癌的表达人乳头瘤病毒16型（hpv16）l1，l2e7蛋白的非复制重组痘苗病毒疫苗株。方法 以痘苗病毒为载体，利用同源重组技术筛选共表达hpv16 l1，l2e7蛋白的重组痘苗病毒，用pcr和western blot技术进行鉴定。结果 该病毒在鸡胚成纤维细胞（cef）中连续传代15代，经pcr检测证实病毒基因组中有hpv16 l1，l2e7目的基因插入，western blot检测证实病毒可以稳定表达l1和l2e7蛋白。结论 构建的病毒ntvjl1l2e7可以在真核细胞中表达hpv16 l1和l2e7蛋白，可以作为治疗和预防hpv16相关疾病的候选疫苗。
【关键词】 人乳头瘤病毒 痘苗病毒 疫苗
大量的研究证实，高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus, hpv）的慢性持续感染是宫颈癌及其癌前病变发生的主要病因［1，2］。尤其是hpv16，18型，占所有病例的70％以上［3，4］。研制宫颈癌预防和治疗性疫苗是目前防治hpv相关疾病的途径。本研究利用非复制痘苗病毒为载体，成功构建了表达hpv16 l1、l2和e7蛋白的非复制重组痘苗病毒，目的在于获得用于预防和治疗hpv相关疾病的疫苗。
1 材料和方法
1．1 质粒 pneojsd7.5l1h6l2e7：痘苗病毒表达质粒。Www.11665.COM含反向串联的痘苗病毒天坛株启动子7.5k和h6，其中7.5k启动子表达hpv16 l1基因，h6启动子表达hpv16 l2e7融合基因，其侧翼序列为痘苗病毒天坛株的tk基因。由中国疾病预防控制中心病毒病研究所病毒应急技术中心构建并保存。
1．2 病毒 ntvjlac痘苗病毒：为tk区表达大肠杆菌β半乳糖苷酶基因lacz的非复制痘苗病毒，由中国疾病预防控制中心病毒病研究所病毒应急技术中心构建［5］、保存。ntvjtk+δck：为缺失了ck区的非复制痘苗病毒。由中国疾病预防控制中心病毒病研究所病毒应急技术中心构建、保存。
1．3 细胞株 鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast，cef）：用8～9日龄无鸡白血病病毒的鸡胚，按常规方法制备。
1．4 主要试剂 hpv16 l1、l2、e7多克隆抗体为中国疾病预防控制中心病毒病研究所病毒应急技术中心制备，为豚鼠多抗；辣根过氧化物酶（hrp）标记的山羊抗小鼠igg购自北京中山生物技术有限公司；转染用lipofectin为gibco公司产品；细胞培养用琼脂（agar nobel），为difgo（usa）产品；xgal，为figo公司产品；化学发光检测试剂盒，为pierce公司产品； pcr过程中的各种工具酶和dna分子量标准主要购自大连takara公司； hpv16 l1全基因上下游引物、l2上游引物及e7下游引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。
1．5 病毒的构建、筛选和纯化 选择培养24～36h、80%～90%成片的鸡胚成纤维细胞，感染0.01～0.1pfu/ml的亲代痘苗病毒ntvjlacz，将pneojsd7.5l1h6l2e7痘苗病毒表达质粒用脂质体转染试剂lipofectin转染细胞（具体操作按gibco公司试剂盒使用说明进行），33℃继续培养60～72h后收获细胞，冻融3次，重组病毒上清液用于重组病毒的筛选。采用g418neo及蓝/白斑双重筛选方法筛选重组病毒。已长成单层的cef细胞感染重组液病毒，在含g418的生长液中继续培养2代，获得富含neo基因的重组病毒。然后换用不含g418的生长液中继续培养1～3代，脱去neo基因。将收获的病毒液进行连续10倍稀释后感染cef细胞，33℃培养60～72h，选择病毒斑密度适宜的培养瓶进行铺斑。铺斑液为含200μg/ml xgal，50μg/ml中性红，5.2%琼脂（agar noble，difco）的维持液。等出现白斑后进行随机挑选单斑。将挑出的白色病毒单斑移至1ml鸡胚成纤维细胞维持液中，-70℃冻融3次。取适量病毒液稀释后接种鸡胚成纤维细胞，培养60～72h，选择合适稀释度进行铺斑，随机挑选孤立的白斑。如此连续单斑纯化5～8次，将纯化获得的单斑重组病毒感染鸡胚成纤维细胞进行扩增，直到获得所需滴度的重组病毒。分装至冻存管中，-70℃保存。
1．6 pcr法检测重组病毒中的目的基因 重组痘苗病毒感染鸡胚成纤维细胞，提取其中重组病毒的dna，溶于三蒸水中备用。利用hpv16 l1全基因的上下游引物（lf，lr），用pcr的方法来扩增重组痘苗病毒中的l1基因，用hpv16 l2的上游引物和e7的下游引物来扩增重组痘苗病毒中融合基因l2e7。同时设阳性质粒和阴性病毒对照。用0.8％的琼脂糖凝胶电泳来鉴定扩增产物的大小，根据扩增产物的大小来判断所重组的痘苗病毒是否含有目的基因。
1．7 western blot鉴定重组病毒中的目的蛋白 用10pfu/ml重组痘苗病毒感染cef细胞，24h后刮下细胞，重悬于100μl 1×sds加样缓冲液，混匀，超声裂解离心后取上清，100℃加热变性5min，取20μl样品于12%sdspage胶，进行电泳。转印硝酸纤维素膜，同时设阴性和阳性蛋白对照，分别用抗hpv16 e7、l1、l2蛋白的多克隆抗体为第一抗体，proteina/g抗体为第二抗体，采用化学发光试剂盒检测l1、l2e7蛋白的表达，详见试剂说明书。
2 结果
2．1 重组痘苗病毒的构建 将痘苗病毒tk区表达质粒pneojsd7.5l1h6l2e7通过脂质体转染技术，转染到被ntvjlac病毒感染的cef中，经过同源重组、蓝白斑筛选、纯化和扩增，从而获得表达hpv16 l1和l2e7蛋白的非复制痘苗病毒ntvjl1/l2e7，见图1。该株病毒经鸡胚成纤维细胞连续传代培养15代仍保持稳定。
2．2 pcr法鉴定重组痘苗病毒中的目的基因 在此实验中，采用了hpv16 l1全基因的上下游引物扩增l1基因，用hpv16 l2的上游引物和e7的下游引物扩增融合基因l2e7。分别在1 500bp和1 800bp的位置出现条带，见图2，分别与预期的l1（1 500bp），l2e7（1 800bp）基因的大小相同。
2．3 western blot鉴定重组病毒中的目的蛋白 化学发光试剂盒检测hpv16 l1、l2e7蛋白在cef中的表达。结果显示，在分子量约50kd和90kd的位置出现l1和l2e7特异性条带见图3。
3 讨论
宫颈癌是危害女性的重要疾病之一，占女性恶性肿瘤的第二位［6］。大量研究证实hpv感染是宫颈癌及其癌前病变发生的主要原因［7］，其中hpv16是最主要的型别［8］。研究表明机体的免疫状态与hpv感染密切相关，正是hpv感染和机体免疫系统之间有密切的相关性，人们意识到可以利用hpv疫苗的策略来防治hpv相关疾病。由于hpv在体外难以培养和大量扩增，人们只能用基因工程来构建hpv疫苗。hpv16的主要衣壳蛋白l1在诱发机体产生型别特异性抗体方面的作用最强［9］，并且可以在体外自我装配成病毒样颗粒（viruslike particle ,vlp），已经在许多动物试验和临床试验中证明具有良好的预防hpv感染的能力［10，11］。人类首个以vlp为基础的宫颈癌疫苗，gardasil，已经通过了美国fda的批准而上市［12，13］。
hpv的早期蛋白e6、e7是诱导和维持细胞恶性表型的主要蛋白，它们在宫颈上皮中持续存在，因此它们成为hpv治疗性疫苗主要的靶抗原。为了达到兼顾预防和治疗hpv相关疾病的目的，在我们构建的疫苗中，同时含有hpv16 l1，l2，e7基因，主要是想在机体诱发针对l1和l2的中和抗体以及针对e7的细胞免疫应答，从而达到疫苗预防和治疗hpv感染的效果。由于e7基因的分子量较小，表达的蛋白半衰期短，抗原性弱。故此我们在构建非复制型痘苗病毒ntvjl1/l2e7时，将l2和e7融合成为l2e7融合基因，目的是使其分子量变大（约90kd），使所得蛋白的结构稳定，从而刺激机体产生强的免疫反应。由于野生型e7所具有致癌性，本研究的前期工作中已经将e7在prb结合位点的两个关键氨基酸-24位的半胱氨酸和26位的谷氨酸的密码子分别突变为甘氨酸的密码子ggt和ggg，并证实了它用于疫苗构建的安全性［14］。
疫苗的效果同样取决于运载外来抗原的载体的性质和效率。在我们的研究中，我们使用了非复制痘苗病毒作为载体系统。痘苗病毒本身具有宿主范围广，无致癌性，抗原性稳定，免疫力持久，能诱发细胞免疫和体液免疫等特点，使之成为基因工程研究中的高效表达载体。与国外同类研究中常使用的复制型痘苗病毒不同，本研究中使用了非复制痘苗病毒载体，在人体中不能繁殖，却能有效表达外源基因，避免了复制型痘苗病毒带来的安全性问题，降低了痘苗病毒本身所带来的毒副作用。同时考虑到疫苗的遗传稳定性问题，避免在痘苗病毒的多个非必需区插入外源基因所带来的重组病毒生物学性状的不稳定，我们只将外源基因插入到痘苗病毒的同一个非必需区（tk区），目的为了所构建的病毒疫苗保持遗传稳定性。经pcr和western blot证实，我们构建的ntvjl1/l2e7可以在真核细胞中（cef）稳定表达l1和l2e7蛋白，在cef中传代15代仍保持稳定，实现了我们预期的构建策略。
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