【摘要】 目的：后肢远程缺血预处理对急性心肌缺血再灌注与心交感神经损伤影响的实验研究。方法：20只雄性新西兰大白兔随机被均分成两组：对照组及远程缺血预处理（ripc）组。两组均制作心肌缺血模型。ripc组在心肌缺血前行双后肢短暂缺血预处理2次（充气式压力止血带环扎双后肢腘窝上1/3，压力26.6 kpa，每次10min，间隔10min），最后一次后肢缺血预处理后再灌注60min制作急性心肌缺血模型。其方法为：冠状动脉左前降支完全闭塞45min，于松开结扎圈再灌注2、4 h时，分别以131碘-间位碘代苄胍(131i-mibg)、99m锝-甲氧基异丁基异腈(99mtc-mibi)双核素作放射自显影，其后以美蓝、氯化四唑（ttc）作组织染色，分别确定心肌危险梗塞灶与实际梗塞灶。结果：再灌注4h后，预处理组危险梗塞灶与实际梗塞灶均小于对照组(p<0.01)。131i-mibg及99mtc-mibi自显影在同一区域摄取存在差异性,两组131i-mibg显影缺损面积(40.8±3.2)%，均显著比99mtc-mibi显影缺损及实际梗塞灶大(p<0.05)。结论：远程预处理能有效阻断心肌缺血再灌注对交感神经损伤的作用；利用交感神经显影剂mibg显影能客观监测心肌梗塞病变范围和程度，评价远程预处理的心肌保护效应。
【关键词】 缺血预处理，心肌；心肌再灌注损伤；交感神经系统；放射性核素显像
abstract：objective:to study the effects of lower extremities remote preconditioning on cardiac muscle ischemic reperfusion and sympathetic nervous injury.methods:twenty male new zealand white rabbits were randomly average divided into two groups: control group (group c) and remote ischemic preconditioning group (group ripc). mode of cardiac muscle ischemic all made in two groups. before left anterior descending coronary artery were occluded, a hind-limb ischemia preconditioning 2 times with obstructed by inflated blood pressure cuff keep on 200 mmhg for 10min with 10min interval, then followed by 60min reperfusion. autoradiography with 131i-metaiodobenzyguanidine (131i-mibg) and 99mtc- sestamibi (99mtc-mibi) were respectively performed in all rabbits of which left anterior descending coronary artery was completely occluded for 45min and followed by 2h，4h reperfusion. the area at risk and the infarct size were determined by staining with methylene blue and triphenyl tetrazolium chloride (ttc) respectively. results:after 4h reperfusion, compared with group ripc, whether risk or infarct areas,131i-mibg and 99mtc-mibi defects increased (p<0.01) in control group.131i-mibg autoradiaography imaging defected area of two groups was larger than that of 99mtc-mibi imaging defected and infarct area size. conclusion: remote ischemic preconditioning pretreatment significantly reduces myocardial infarction area induced from ischemia reperfusion injury in rabbits. mibg can monitor the infarct areas and extent, it have favourable objectivity to evaluate myocardial preservation effect by ripc.
author′s address：department of anesthesiology，wurumqi general hospital，lanzhou military district，wurumqi，xinjiang,830000，china
key words：ischemic preconditioning, myocardial; myocardial reperfusion injury; sympathetic nervous system; radionuclide imaging 心肌梗塞后，血浆内儿茶酚胺瞬间升高，梗塞病灶与非梗塞区内去甲肾上腺素(ne)有不同程度耗竭，交感神经活性与分布发生变化，心交感神经元突触信号传导受阻，容易导致心律失常等并发症。Www.11665.cOM近年来，有不少学者证实，肢体[1]、腹腔动脉[2]、肠[3]等器官的短暂缺血可以减轻随后发生的心肌缺血再灌注损伤，由此提出了“远程缺血预处理（remote ischemic preconditioning，ripc）”的概念，为缺血预处理临床应用带来了希望。本实验拟以活体兔为实验对象，经双下肢缺血预处理诱导缺血耐受，通过结扎冠状动脉左前降支，建立急性心肌梗塞动物模型，利用心肌灌注显影剂99m锝-甲氧基异丁基异腈(99mtc-mibi)及交感神经受体显影剂131碘-间位碘代苄胍（131i-mibg）进行双核素放射自显影，根据显影结果，结合美蓝、氯化四唑（ttc）染色，选择感兴趣区，通过软件分析，定量测定并比较131i-mibg与99mtc-mibi在同一部位摄取比率，探讨远程预处理对心肌缺血再灌注与交感神经损伤的保护作用，进一步明确该预处理方法的作用机制。
1 资料与方法
1.1 实验动物雄性新西兰大白兔20只，体重（3.5±0.4）kg，由本院临床医学实验研究所提供。
1.2 试剂 131i-mibg（特异活度2030.5mbq/mmol)购自北京401核能原子研究所，放化纯98%。99mtc-mibi（特异性活度33150.2 mbq / mmol)，购自广东希埃核药学公司，放化纯99.1%。磷酸盐缓冲液(pbs 10g/l),ttc(2,3-triphenyl tetrazolium chloride，sigma公司)。
1.3 主要仪器storm860标准磷屏(分子动力公司,美国)，奥林帕斯光学显微镜及数码相机(日本)，leica-cm1900恒温冰冻切片机(leica,德国)，jeol-jem-100sx透射电镜(jeol,日本)，uthscsa imagetool(it)3.0面积分析软件及adobe photoshop 6.0公用软件。
1.4 建立预处理模型20只雄性新西兰大白兔，随机均分成对照组及远程缺血预处理（ripc）组（每组各10只）。两组在制作心肌缺血前90min经耳缘静脉给予戊巴比妥钠30mg/kg麻醉；远程缺血预处理组在静脉给予戊巴比妥钠麻醉后，行双后肢短暂缺血2次（充气式压力止血带环扎双后肢腘窝上1/3，压力26.6kpa，每次10min，间隔10min）。实验中肛门留置温度计（509监护仪，american）,使用恒温箱控制体温在36.5℃～37.5℃，以排除温度对实验结果的影响。
1.5 心肌缺血模型a、b两组均制作心肌缺血模型。b组最后一次预处理后60min，依据fukuchi k等方法[4]制作心肌缺血模型。心肌缺血模型制作方法：沿胸骨左侧第5肋间隙开胸(不破坏胸膜)靠近冠状动脉左前降支近端游离冠脉约1.0cm，5/0无创缝合线穿过动脉，套管法(图1)结扎45min，松开结扎圈2h，形成心肌缺血再灌注损伤模型。术中及时、合理追加麻醉药，确保手术顺利进行且不抑制呼吸。
1.6 双核素示踪药物给药方法心肌缺血再灌注2h，将活度为13.875mbq的131i-mibg，沿耳缘静脉注入，2h后再将活度为175mbq的99mtc-mibi注入同一静脉。15min后结扎动脉，将2.0ml美蓝，直视下注入左心室，3min后用过量100g/l氯化钾处死动物，迅速摘除心脏，以0℃ 10g/l pbs冲洗附着在心脏表面血迹，冰冻切片包埋剂（oct）包埋心脏，-80℃冰箱速冻备用。实验流程见图2。
1.7 病理检查沿心尖向基底部短轴连续切片，厚约5mm并观察切面颜色。随后放置在恒温37℃含10g/l ttc的10 g/l pbs(ph=7.4)中孵育20min，行ttc染色。组织染色后放入40g/l甲醛溶液中浸泡24h。注入美蓝后，阻塞部位因血运受阻导致美蓝染色缺损，定义为危险梗塞灶[5]，经ttc染色而出现苍白区，定义为实际梗塞灶。利用图像分析仪imagetool(it)3.0，对两种染色差异性进行分析后转化为相应的数据（%）。对照组〖4〗心肌缺血 注：a,b,c,d各时间点分别注入131碘-间位碘代苄胍，99m锝-甲氧基异丁基异腈，美蓝，氯化钾。
1.8 心脏切片放射自显影操作及处理 取oct包埋冻存的心脏，恒温-20℃下，沿心尖向基底部连续切片，每切30次收集一次厚度为20μm的切片，作为自显影样本；或5μm切片作h-e染色，按i-gawa等[6]的方法，稍加修改进行双核素放射自显影。将20μm切片放在预冷清洁透明的胶片上并烘干，平铺在磷屏上，4℃曝光10h，磷屏扫描成像，根据显影结果，结合染色组织差异，选择感兴趣区，利用imagetool(it)3.0分析软件，定量测定显影相素间灰度差异值，定量分析显影区99mtc的分布。以清屏器处理磷屏并放置3d，待切片及残留在磷屏表面的99mtc完全衰变，再将同一显影切片放置在磷屏上曝光4d，按上述处理程序，获得131i-mibg自显影。由于99mtc半衰期为6.02h，而131i为8.04d，后者核素半衰期为前者数十倍，两者之间自显影图像影响不足1%，根据yoshioka等[7]系列实验可以忽略不计。
1.9 统计学处理用spss10.0统计软件对所得的数据进行分析，数据用均数±标准差(±s)表示，不同组别间采用完全随机配对性t检验或单因素方差分析，p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
使用adobe photoshop6.0图片编辑器及imagetool(it)3.0软件，将131i-mibg、99mtc-mibi自显影与大体组织染色进行数据转化。结果见表1。
2.1 美蓝、ttc染色结果对照组经美蓝染色，其危险梗塞灶缺损比值为（36.4±2.2）%，高于预处理组(p<0.01),其比例约38%。同样，对照组经ttc染色，实际梗塞灶为（33.6±2.4）%，高于预处理组(p<0.01)，其比例约45%。
2.2 体外131i-mibg与99mtc-mibi放射自显影量化分析结果
2.2.1 131i-mibg自显影结果:同预处理组比较，对照组mibg自显影缺损度远大于预处理组(p<0.01)。预处理组mibg缺损比率超过了美蓝缺损度，两者之间比率为(28.7±2.3）%∶（23.2±1.8）%(p<0.01)。
2.2.2 99mtc-mibi自显影结果：99mtc-mibi自显影缺损度，对照组缺损度较大，与预处理组比较具有显著性差异(p<0.01)，与同组ttc染色总体差异性不显著(p>0.05)。
2.2.3 131i-mibg与99mtc-mibi显影结果对比：比较131i-mibg与99mtc-mibi显影相对应区域:mibg显影缺损度均大于mibi(p<0.01)。详见表1。 表1 两组急性心肌梗塞区量化结果(n=10，
2.3 ▲131碘-间位碘代苄胍40.8±3.2 ▲▲28.7±2.3 △△▲▲99m锝-甲氧基异丁基异腈34.3±2.7##18.6±2.2 △△## 注：与对照组比较△△p<0.01；与131碘-间位碘代苄胍显影缺损度比较##p<0.01；与美蓝染色比较▲p<0.05，▲▲p<0.01。
3 讨 论
1986年，murry等[8]首先发现心肌反复短暂缺血可以限制随后较长时间心肌梗塞的范围，因此提出了心肌缺血预适应的概念，即心肌能从短暂的缺血中产生内源性保护作用，对随后较长时间缺血具有保护作用。随后的研究表明，缺血预处理是机体的一种内源性保护机制[9]。1993年，przyklenk[10]等首次报道在狗的心脏缺血模型中，当给予一个血管区域缺血预处理后，可使远离该区域的心脏组织产生缺血耐受，这一发现，促使研究者思考缺血预处理效应是否存在组织器官交叉保护现象这一问题？随后的研究结果支持了这一假设。gho等[11]证实肾脏缺血预处理可诱导心脏缺血耐受，oxman等[12]发现给与大鼠下肢10min的短暂缺血，可对随后的心肌缺血产生保护作用，人们称此现象为远程预处理(remote preconditioning，rpc)：即给予远离缺血部位的组织或器官短暂缺血，可对缺血部位产生保护作用。诱导缺血耐受，为缺血预处理的操作性和临床应用提供了新的思路。 既往研究表明[13]，心肌梗塞后，心交感神经兴奋性增强，早期能导致心律失常等多种并发症。由于去甲肾上腺素(ne)类似物间-碘苄胍(mibg)，为假性神经递质，在心脏特异性传导体系中，被神经原摄取、储存、释放与ne基本一致，随心肌血运至交感神经末梢，与特异性转运蛋白结合，聚集在交感神经元节后神经节，而与磷苯二酚-0-甲基转移酶及单胺氧化酶受体配体结合传递信号，但不能进入细胞参与氧化代谢。利用mibg这一特性，经核素标记作为受体显影示踪剂。1988年minardo等[14]首先将mibg用于研究狗的心肌梗塞病动物模型，分别用药物损伤心交感神经或结扎冠状动脉左前降支，建立狗心肌梗塞模型，同时应用123i-mibg和201te进行显影对照，并用电生理学方法检测相应区域，发现梗塞部位交感神经损伤的分布与实际梗塞灶之间，具有显著不匹配性，123i-mibg显影缺损始终大于201te。同年，sisson等[15]用该模型，获得相似结果。就预处理而言，目前国内外文献尚未有以放射性核素显影研究远程预处理对心肌保护作用的报道，另外研究表明远程预处理的保护效应具有全身效应，其保护作用与神经、体液因素具有显著的关系[16]，且需要相关的触发机制[17]。因此，本实验选择131i-mibg、99mtc-mibi双示踪自显影，研究远程预处理对心肌缺血再灌注损伤对交感神经损伤的影响，结果表明：在远程预处理组中，mibg缺损度明显比对照组缺损度小，且两组中mibg缺损度均大于mibi所显示的缺损度，表明急性心肌缺血再灌注损伤与交感神经损伤具有密切的关系，该预处理模式对心肌缺血再灌注时交感神经损伤具有保护作用。既往研究证实，缺血预处理在不同种属动物中能减少心肌梗塞面积75% 左右[18]，另有研究表明心肌梗塞模型中，肢体缺血预处理诱导的保护效应可减少心肌梗塞的面积达50%左右[19]，本研究结果与文献报道的结果基本一致，从核医学的角度进一步证明了远程预处理对心肌的保护作用，其保护作用与减轻交感神经的损伤具有密切关系。 研究显示，123i-mibg与99mtc-tetrofosmin双示踪spect显影，交感神经损伤主要表现在急性期，而远期显影规律性较差[20]。在狗心肌梗塞再灌注模型急性心肌梗塞时，交感神经损伤范围比实际梗塞灶早而且广泛，尤其在梗塞病变发生几小时内最明显[21]。由于缺血预处理具有早期效应和延迟效应两个时间窗[22]，为便于研究和观察，本实验选择早期效应进行研究。实验观察到心肌梗塞早期，利用双核素示踪放射自显影，显示出心交感神经损伤度远超过实际梗塞灶。其机制可能为发生梗塞导致区域性供血障碍，引起神经突触前结构损害，反射性激活交感神经末梢，血管持续痉挛，交感神经进一步损伤，神经末梢内atp大量耗竭，由于神经末梢对atp的依赖性远超过心肌细胞对atp的依赖，利用mibg显影就出现区域性结构改变，从而使交感神经颗粒超微结构的损害程度明显比心肌细胞损害程度重。 上述实验结果表明远程预处理对缺血心肌的保护作用与抑制交感神经的损伤具有密切关系，其它保护机制可能与增强心肌细胞对缺血缺氧的耐受[23,24]，促进缺血再灌注后心功能的恢复[25,26]，抑制缺血再灌注心肌细胞的凋亡[27,28]，减少缺血再灌注后心律失常的发生，以及降钙素基因相关肽的表达[29～31]等有密切关系。当然，其具体的作用机制以及各机制间共同的作用途径尚需进一步研究。
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