【摘要】 目的：观察慢性冬眠心肌（chm）间质变化及其对心功能的影响。 方法：对小型猪采用球囊扩张及内膜剥脱术，造成心脏左前降支中段狭窄、心肌慢性缺血，建立chm模型。24只小型猪被分成：chm组和假手术组，于模型建立后4周、12周终止实验。心脏切片以he染色，透射电镜观察组织形态学；以苦味酸天狼星红(psr)染色，偏光镜观察间质胶原纤维类型和比例；以免疫组化法测定间质糖蛋白、纤维结合蛋白（fn）和骨桥蛋白（opn）；以超声心动图观察左室收缩功能。结果：较之假手术组（1）chm的间质空间扩大，成纤维细胞增多，胶原增生；（2）chm的间质胶原容积分数（icvf）、血管周围胶原容积分数（pcvf）及光密度积分（iod）、fn和opn均明显增加，并随时间延长而增加(p<0.01)；（3）psr染色偏光镜观察示chm组ⅰ型胶原大量聚集，排列紊乱，ⅲ型胶原少量，ⅰ/ⅲ胶原比例增高；（4）chm组的左室射血分数（lvef）、左室短轴缩短率（lvfs）、室壁增厚率（%wt）显著降低(p<0.01)；（5）胶原纤维含量与lvfs、lvef和%wt呈高度负相关(r=-0.754～-0.872，p<0.01)。结论：慢性冬眠心肌出现间质重塑。
【关键词】 冠状动脉疾病；心肌顿抑；纤维胶原类；糖蛋白类；心室重构
abstract：objective:to explore whether there was a progressive remodeling of the interstitium in chronic hibernating myocardium (chm), and to determine whether these alterations affect the cardiac function.methods:percutaneous balloon coronary inflation and endothelium denudation were used to develop a stenosis of the left anterior descending coronary arteries and then to create a model of chm in swines.twentyfour swines were assigned to two groups：group chm and group of sham operation(sham).at the end of the study, heart was harvested.hematoxylineosin(he) staining and electron microscopy were used to detect the histological and ultrastructural changes.picrosiriusred staining and polarized light microscopy were conducted to analysis the changes in the type and proportion of collagen fibers.immunohistochemistry was used to detect two glycoproteins (fibronectin and osteopontin) respectively by their antibodies.echocardiography was performed to measure the function of the left ventricle.results:(1) enlargement of interstitial space, proliferation of fibroblasts, hyperplasia of collagen fibers were observed in group chm; (2) compared with group sham, both interstitial collagen volume fraction (icvf), perivascular collagen volume fraction (pcvf) and iod of group chm were significantly increased, and the similar alteration was observed in the expression of two glycoproteins, fibronectin and ostopontin in extracellular matrix (p<0.01); (3) a large number of disarranged collagen fibrils of type i with a small amount of type ⅲ collagen fibers were in interstitium of chm,accordingly, the ratio of collagen i to collagen ⅲ increased; (4) left ventricular fraction shortening (lvfs), left ventricular ejection fraction(lvef) and wall thickening(%wt) were significantly lowered in group chm, respectively (p<0.01); (5) content of collagen fibers were highly negatively correlated with lvfs, lvef and %wt, respectively(r=-0.754～-0.872，p<0.01).conclusion:remodeling of myocardial interstitium are observed in chm.
author′s address：department of cardiology,people′s hospital of fujian province,fuzhou,fujian,350007,china
key words：coronary artery disease;myocardial stunning;fibrillar collagens; glycoproteins; ventricular remodeling 慢性冬眠心肌（chm）广泛存在于心绞痛、心肌梗塞以及不明原因的左室功能不全患者中[1，2]。wwW.11665.COM以往对冬眠心肌的研究大多着眼于心肌实质,而对心肌间质的形态改变及其病理生理意义关注较少，本研究旨在探讨小型猪慢性冬眠心肌间质变化及其对心功能的影响。
1 资料与方法
1.1 动物分组 槐猪24只，雄性，月龄5～7 个月,体重25～35 kg（购自福建上杭国家级槐猪保种场），被随机分为4组，chm 4周组：6只动物，自心肌冬眠起点继续饲养4周；假手术4周组：6只动物，自假手术后继续饲养4周；chm 12周组：6只动物，自心肌冬眠起点继续饲养12周；假手术12周组：6只动物，自假手术后继续饲养12周。
1.2 实验方法
1.2.1 模型制备：对实验组槐猪采用球囊冠脉扩张及内膜剥脱术造成冠脉左前降支（lad）中段狭窄、心肌缺血及慢性心肌冬眠模型。选择左前降支中段, 定量冠状动脉造影(qca) 测定直径,以球囊∶血管＝1.3∶1的比例,球囊压6～16 atm扩张并来回拉3次,每次30s,间隔为1min，形成冠状动脉损伤。假手术组只进行冠脉造影，不进行球囊扩张。
1.2.2 冠状动脉造影：分别于术后4周、12周重复冠状动脉造影，选择舒张晚期造影图像，采用qca技术定量测量冠状动脉直径狭窄率。
1.2.3 左心室射血分数（lvef）、左室短轴缩短率（lvfs）、室壁增厚率（%wt）：分别于术后2 h、4周、12周进行超声心动图检测。具体如下：取乳状肌水平左心室短轴切面图像，应用m型超声心动图连续测量3个不同心动周期，每个测值均为三次测值的平均值。采用计算机辅助收缩功能定量分析法进行%wt计算，%wt =(ths-thd)/thd×100%,其中ths、thd分别代表收缩末期及舒张末期室壁厚度。
1.2.4 室壁运动分析 （1）静息室壁运动分析：按照美国超声协会左心室16节段划分法，以目测半定量法评估lad供血区室壁运动情况(1～4 分):1 分为运动正常；2 分为运动减弱；3 分为运动消失；4 分为矛盾运动。计算室壁运动积分指数(wmsi)，wmsi = 各节段记分之和/总节段数,正常为1；（2）腺苷负荷超声心动图试验（ase）：室壁运动分析[3] 在心电监测下,先以腺苷100μg/kg·min静脉连续推注、持续5 min；若未检出局部心室壁收缩功能变化，继以最大剂量200μg/kg·min静脉连续推注、持续5 min。室壁收缩功能变化的类型分为：①持续改善：代表非心肌缺血；②双相反应：代表存活的冬眠心肌；③无变化：代表不存活的坏死心肌。
1.2.5 光镜观察：所有心脏标本从心尖起，垂直左心室长轴切成5mm薄片，取lad所支配的左室前壁(避开局灶性心肌梗塞部位)和正常心肌组织，二者都包括心内膜至心外膜的全层心肌，按常规石蜡包埋后，每个组织块做连续5μm切片。he染色及苦味酸天狼星红（psr）染色[4]。
1.2.6 透射电镜观察：在灌注中性甲醛溶液前分别取假手术组和chm组术后4周、12周的心室组织1mm3大小各一份，以3%戊二醛、1.5%多聚甲醛、0.1m 磷酸盐缓冲液（pbs，ph7.2)于 4℃作前固定，3d后送福建医科大学电镜室，经醋酸铀、柠檬酸铅染色制片后在日立hu-12a型透射电镜下观察。
1.2.7 胶原面积、含量（光密度）：定量分析 psr染色切片，光镜下放大100倍，取心肌组织及血管周围组织(避开心外膜下区域），测定胶原面积所占视野总面积的百分比（icvf、pcvf），随机计算10个视野，而后取平均值，同时测定同一视野下平均光密度积分(iod)，代表胶原含量。
1.2.8 纤维结合蛋白（fn）、骨桥蛋白（opn）表达阳性率：fn、opn阳性反应定位于心肌间质细胞(包括血管内皮细胞)，呈棕黄色颗粒，位于细胞胞浆。分别在fn、opn免疫组化染色切片中随机选取10个视野，以计算机辅助图像分析系统（imagepro plus, version：4.5）计算胞浆染色阳性细胞占全部视野细胞面积百分比，而后取平均值。
1.3 统计学处理 所有实验数据以均值±标准差(±s)表示，用spss 11.5统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，两变量间的相关分析采用线性相关。p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 一般情况14只猪参与冬眠模型组制作，除1只术中死于心室颤动、另1只术中死于心包填塞外，其余12只猪均顺利完成了所有实验步骤，其中5只猪出现病变中心小灶性心肌坏死(chm 4周组2只，chm 12周组3只)。chm 4周组和chm 12周组各6只符合慢性冬眠心肌标准。假手术对照组所有动物无死亡及心肌坏死。
2.2 冠状动脉狭窄程度 在实验结束时，qca法测量chm 4周及chm 12周组的冠状动脉直径狭窄率分别为（90±6）%及（93±4）%。对照组动物冠状动脉造影未见狭窄。
2.3 超声心动图室壁运动分析 静息时，假手术组无室壁运动障碍，chm 4周和chm 12周组lad供血区域有不同程度室壁运动障碍情况见表1；ase时，chm 4周、chm 12周组lad供血区域室壁运动障碍情况及其变化见表2。表1 各组小型猪静息超声心动图室壁运动障碍程度及节段数比较 注：chm 慢性冬眠心肌。各组动物数均为6只，按ase的16节段划分法左心室节段数量均为96（下表同）。与假手术组比较△△ p<0.01；与chm 4周组比较▲▲p<0.01。 表2 腺苷负荷超声心动图试验（ase）室壁运动障碍程度及节段数比较 注：与假手术组比较△p<0.05。
2.4 光镜与电镜观察 假手术组心肌结构无明显异常。chm 4周组心肌纤维数量减少，走向不规则，细胞变性、水肿、灶性坏死，间质中胶原增生；电镜下局灶性肌丝断裂、溶解，肌节紊乱，线粒体肿胀、嵴紊乱、断裂，肌浆网扩张，核周空区增大；成纤维细胞增生，核大、高尔基器发达, 内质网扩张, 内充满有形物质。chm 12周组病变更为明显，肌纤维断裂溶解，部分细胞萎缩，间质空间扩大，大量胶原增生，呈栅栏状包裹心肌细胞；电镜下肌丝肌节紊乱，肌原纤维脱失，大量小线粒体，t 管减少，核畸形，胶原含量明显增多，部分呈束状或网状分布。
2.5 psr染色偏振光显微镜下观察 chm组有黄红色双折光ⅰ型胶原大量聚集,排列紊乱,有少量绿色弱双折光ⅲ型胶原，ⅰ/ⅲ胶原比例增高。chm 12周组心肌ⅰ型、ⅲ型胶原均较chm 4周组更加明显和广泛，平行交错紊乱排列，其中以黄红色ⅰ型胶原增加最为明显。
2.6 胶原面积、含量（光密度）定量分析 与同期的假手术组比较，chm 4周组心肌间质组织icvf、pcvf及其iod均明显增加；chm 12周组与chm 4周组相比，icvf、pcvf及其iod增加更为显著(p均<0.01)，见表3、4。表3 各组小型猪慢性冬眠心肌间质胶原纤维含量的变化 注：与假手术组比较△△p<0.01；与chm4w组比较▲▲p<0.01。下表同。表4 各组小型猪慢性冬眠心肌血管周围胶原纤维含量的变化
2.7 fn、opn表达阳性率 免疫组织化学结果显示：与假手术组相比，不同时间点chm组心肌间质组织糖蛋白fn、opn表达水平均显著增加(p<0.01)，其变化呈上升趋势，即chm 12周组与chm 4周组相比有明显增高(p<0.01)，见表5。表5 各组小型猪慢性冬眠心肌间质糖蛋白含量的变化
2.8 lvef、lvfs和%wt心肌冬眠慢性过程中，心脏的整体和局部收缩功能均呈下降趋势，表现为chm组的lvef、lvfs和%wt都比同期的假手术组显著降低以及chm 12周组的lvef、lvfs和%wt比chm 4周组的显著降低(p均<0.01)，见表6。 表6 各组小型猪慢性冬眠心肌心功能的变化
2.9 心肌间质变化对心功能的影响 对心肌间质各成分变化与超声心动图测量的各项心功能指标进行相关分析发现两组指标间具有较高程度的负相关性，见表7。 表7 各组小型猪慢性冬眠心肌心功能的相关性分析 注：p均<0.01
3 讨 论
心肌冬眠是缺血心肌避免坏死的一种自我保护机制，及时血运重建可使冬眠心肌功能恢复正常或接近正常，而延期血运重建不仅使冬眠心肌产生细胞慢性丢失[5,6]，还可能会发生心肌间质变化。关于冬眠心肌的产生机制及其结局是近年的研究热点[7]。 本研究观察到：心肌冬眠后间质和血管周围胶原纤维含量明显增多，并随时间推移而加重，psr染色显示ⅰ、ⅲ型胶原均明显增生，尤以ⅰ型胶原大量聚集,排列紊乱,ⅰ/ⅲ胶原比例增高。光镜及电镜观察显示心肌间质成纤维细胞增殖，心肌灶性纤维化。提示慢性冬眠心肌存在胶原纤维增生以及胶原类型和比例的改变。心肌胶原网络重塑是导致心肌间质重塑主要因素，可造成左心室僵硬、舒张功能异常；血管外周纤维化致管壁弹性改变，硬度加大，限制了冠脉舒张，大量胶原蓄积还会影响心肌细胞力的产生和传递，收缩功能亦会受损，最终产生心力衰竭。 fn为细胞间质中的糖蛋白,参与组织的增生、修复、纤维化。研究表明，在主动脉狭窄所致的心肌肥厚中，fn聚积先于胶原聚积，fn和胶原均参与压力负荷对心肌损伤的修复，fn是更敏感指标。在扩张型心肌病患者，fn mrna含量较正常人增加2倍[8]。本研究应用免疫组化法观察fn在chm中表达的变化，结果显示：与假手术组相比，不同时间点chm组间质中fn表达水平均显著增加，其变化呈上升趋势，表明在心肌冬眠过程中，随着胶原纤维的大量增生，fn也在心肌间质中大量表达。动物实验表明：心肌损伤后3d， fn mrna表达即增多，7d时累积显著，其作用与损伤修复有关，因此我们认为，在chm中fn表达增加为慢性低灌注导致心肌细胞受损的结果，反映了冬眠心肌损伤修复的过程，但过度表达则表明间质重塑和纤维化。 opn由成骨细胞、血管内皮细胞等合成并分泌，可通过与整合素家族分子或与cd44结合，激活细胞内特异性信号传导系统而介导细胞粘附、迁移和增殖。opn在醛固酮诱导的心脏重塑中起着重要作用，醛固酮受体拮抗剂防止心肌纤维化部分是通过抑制opn的表达[9]。本研究观察到：chm间质中opn的表达明显增高，并随时间延长而增加。frangogiannis等[6]的研究表明另一种基质糖蛋白tenascin在慢性冬眠心肌间质的表达亦明显增加，因此可以认为，基质糖蛋白表达是慢性冬眠心肌间质重塑活跃的有力证据。同时，我们还观察到fn和opn在间质中的表达随时间延长而增加，表明间质重塑是一进行性发展的过程，提示在临床上应尽早进行血运重建，及时阻断病变发展。 心肌冬眠后可发生与急性心肌梗塞后类似的心室重塑，表现为lvef、%wt下降，左室舒张末期容积（lvedv）及左室重量增加。冬眠心肌实质重塑表现为心肌细胞肥大、变性、左室重量增加以及通过细胞凋亡等使心肌细胞丢失，心肌功能恢复不全或延迟恢复[10]。本研究相关分析显示间质重塑与心功能呈高度负相关，表明在心肌冬眠的慢性过程中，心肌间质重塑参与了心室重塑发生，是导致心功能下降的重要因素之一。心室重塑是心脏疾病-终末性心脏病-慢性心衰演变的核心机制之一，因此，有理由认为，冬眠心肌间质重塑可能是慢性缺血心肌发展为缺血性心肌病、慢性心衰的重要病理生理机制。
【参考文献】
[1]wiggers h, nielsen ss, holdgaard p, et al.adaptation of nonrevascularized human hibernating and chronically stunned myocardium to long|term chronic myocardial ischemia［j］.am j cardiol, 2006，98(12):1574-1580.
［2］陈良龙，沈成兴，葛均波，等.慢性冬眠心肌血运重建后室壁运动功能恢复程度的观察［j］.心血管康复医学杂志，2003，12(1)：8-10.
［3］djorjevic|dikic a, ostojic m, beleslin b, et al.low|dose adenosine stress echocardiography：detection of myocardial viability［j］.cardiovascular ultrasound， 2003，1（1）：7.
［4］梁晓俐.病理学基础与实验技术［m］.北京：军事医学科学出版社，2003:136-137.
［5］陈良龙，罗育坤，邱罕凡，等.多巴酚丁胺对冬眠心肌灌注、代谢及功能的影响及其临床意义［j］.中华心血管病杂志, 2000,28（5）:379-383.
［6］frangogiannis ng, shimoni s, chang sm,et al.active interstitial remodeling：an important process in the hibernating human myocardium［j］.j am coll cardiol, 2002,39:1468-1474.
［7］tadamura e, yamamuro m, kubo s, et al.images in cardiovascular medicine.hibernating myocardium identified by cardiovascular magnetic resonance and positron emission tomography［j］.circulation，2006,113(7):e158-159.
［8］oliviero p, chassagne c, salichon n, et al.expression of laminin alpha2 chain during normal and pathological growth of myocardium in rat and human［j］.cardiovasc res, 2000,46:346-355.
［9］matsui y, jia n, okamoto h, et al.pole of osteopontin in cardiac fibrosis and remodeling in angiotensin ⅱ-induced cardiac hypertrophy［j］.hypertension, 2004,43:1195-1201.
［10］lai t,fallon jt, liu j,et al.reversibility and pathohistological basis of left ventricular remodeling in hibernating myocardium［j］.cardiovasc pathol,2000,9:323-335.
