【摘要】 本研究旨在探讨凋亡存活蛋白survivin在白血病的原代细胞和白血病细胞系中的表达情况，并观察粒巨噬细胞细胞集落刺激因子(gmcsf)对其的影响。用rtpcr方法检测37例白血病患者、10例正常成人骨髓和3种白血病细胞系（k562、hl60、u937）中survivin的表达。以hl60细胞为对象，加入合适浓度的gmcsf，用rtpcr和western blot分别检测加药前后surivin mrna和蛋白水平的变化。结果显示： 37例白血病患者中有25例表达survivin，阳性率为67.6%，其中急性淋巴细胞白血病(all)细胞中survivin mrna表达阳性率为73.3%，高于急性髓系白血病(aml)，但均高于正常对照组（20.0%）(p<0.05)。 3种细胞系k562、hl60和u937全部表达survivin。合适浓度的gmcsf作用2天后，hl60细胞中survivin的表达明显升高，其中mrna水平升高了26%，蛋白水平升高了49%。结论： suvivin在白血病的原代细胞和细胞系中均有较高表达，而gmcsf能显著提高hl60细胞中survivin的水平。
【关键词】 白血病细胞 巨噬细胞细胞集落刺激因子
expression of survivin in leukemia cells and influence on it by gmcsf
wu yaohui, zou ping, liu fang, shen hanbing
institute of hematology, union hospital, tongji medical college, huazhong university of science and technology, wuhan 430022, china
abstract this study was aimed to explore the expression of survivin in leukemia cells and to investigate the effect of gmcsf on survivin expression. the survivin expressions in 37 previously untreated leukemia patients and 10 normal persons as well as in three kinds of leukemia cell lines (k562, hl60, u937) were analyzed by rtpcr. the hl60 cells were treated by the proper concentration of gmcsf, and the changes of survivin mrna and protein expression levels were detected by using rtpcr and western blot respectively. the results indicated that the positive rate of survivin gene in 37 leukemia patients was 67.6% (25/37) and significantly higher than that in normal control (20.0%). the expression level was higher in all cells than that in aml cells (73.3% vs 63.6%). moreover, three kinds of leukemia cell lines all expressed survivin. after treating with the proper concentration of gmcsf for 2 days, the expression of survivin obviously increased and the expression level of survivin mrna was upregulated by 26%, the expression level of survivin protein was upregulated by 49%. it is concluded that the survivin gene extensively express in leukemia and its cell lines, and its expression can be obviously increased by gmcsf.
key words leukemia cell; survivin; gmcsf
j exp hematol 2007; 15(1):6-9
存活蛋白(survivin)作为细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, iap)家族的新成员，由于其在人类正常组织不表达或低表达，而在人类多种肿瘤组织中高表达的特性［1］，有望成为肿瘤治疗的选择性靶点，引起了学者们的广泛关注。WwW.11665.COM现已有研究表明，survivin表达于如结肠癌、肺癌、非霍奇金淋巴瘤等多种人类肿瘤中，且与预后相关［2-4］。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colonystimulating factor, gmcsf)是一种重要的造血生长因子，临床上已广泛用于防治各种原因所致的骨髓损伤和骨髓抑制，但有研究表明gmcsf有抑制白血病细胞凋亡的作用，其具体机制尚不清楚。在本研究中，我们采用rtpcr的方法检测了16例白血病的患者和3种细胞系（k562、hl60和u937）中survivin的表达水平，并以hl60细胞为对象，观察gmcsf作用后细胞中survivin表达改变的情况。
一般资料
本组患者37例均系我院的初治白血病患者，经细胞形态学、骨髓组织学和免疫表型确诊，符合国内诊断标准，其中男23例，女14例，年龄14-69岁，中位年龄42.2岁。按fab标准， 37例急性髓系白血病(aml)22例，包括m1 3例，m2 9例，m3 5例，m4 2例，m5 3例；急性淋巴细胞白血病(all)15例，包括l1 2例，l2 10例，l3 3例。正常对照组10例，其中男6例，女4例，年龄18-44岁，中位年龄33.6岁，均为健康志愿者。
标本处理
无菌操作下取抗凝骨髓液2-3 ml，用ficoll液分离单个核细胞(mnc)，台盼蓝拒染率大于99%。取约5×106个细胞，用pbs洗涤2次，加trizol(gibco公司产品)1 ml混匀后， -80℃保存，待提取rna。
细胞培养
人类白血病细胞系k562、hl60和u937均以含10%胎牛血清的rpmi 1640培养液于37℃ 5% co2条件下培养。另取对数生长期hl60细胞，按2×105/ml的浓度接种于6孔板，每孔5 ml，加入合适浓度的gmcsf(100 u/ml)，培养2天后收集细胞，用于后续试验，并以未加药的hl60细胞为对照。
rtpcr检测
采用rtpcr技术分别检测白血病的原代细胞、 3种细胞系和加了gmcsf作用后hl60细胞中survivin mrna的表达。人类survivin的pcr引物为5＇ctcaaggaccaccgcatctc3＇和5＇cctcaatccatggcagccag3＇，反应产物392 bp; βactin为内参照，引物为5＇tgtacgttgctatccaggct3＇和5＇ctccttaatgtcacgcacga3＇，反应产物247 bp。
rtpcr采取两步法进行。用trizol试剂提取细胞总rna，紫外分光光度计检测其浓度和纯度，逆转录生成cdna。pcr的总反应体系为50 μl，其中包括cdna 3 μl, 10×pcr缓冲液 5 μl, 25 mmol/l mgcl2 10 μl, 10 mmol/l dntp 1.5 μl, taq酶2 u， survivin 上、下游引物各25 pmol, βactin上、下游引物各25 pmol 。反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，58℃复性45秒，72℃延伸1分钟，循环30次，最后72℃再延伸10分钟。pcr产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察、摄相，分析结果。试验重复3次，结果取平均值。
western blot分析
将预冷至4℃的裂解缓冲液加入到经pbs漂洗的第1天和第3天收集的hl60细胞中，冰上作用20分钟，12 000×g离心2分钟后，上清液保存于－20℃； 测定蛋白质浓度，上样，sds－page分离，通过电转移法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，在含5%脱脂奶粉的ttbs中37℃封闭90分钟，加入一抗(兔抗人survivin多克隆抗体，稀释度为1∶1000，美国santa cruz公司产品)4℃孵育过夜，加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg，稀释度为1∶1000，北京中山生物工程公司产品)37℃作用40分钟，化学荧光法(ecl)显色，观察结果。
统计学处理
比较采用χ2检验，使用spss 10. 0软件对实验室结果进行处理。
结 果
survivin mrna在白血病细胞中的表达
在37例白血病患者骨髓中有25例表达survivin mrna，阳性率为67.6%，其中急性淋巴细胞白血病(all)细胞中survivin mrna表达的阳性率为73.3%，较急性髓系白血病(aml)的63.6%稍高，但前二者均高于正常对照组（20.0%）(p<0.05)(表1、图1)。这说明survivin在白血病患者中有较高的表达率。在3种人类白血病细胞系hl60、u937和k562中也有survivin的表达(图2)。
gmcsf对hl60细胞survivin表达的影响
hl60细胞经100 u/ml gmcsf作用2天后， survivin的表达明显升高，其中mrna水平平均升高了26%(图3)，而蛋白水平则升高了49%(图4)。
讨 论
细胞增殖和凋亡的平衡对维持细胞内稳态及组织形态至关重要，平衡的破坏能为存在基因缺陷的细胞提供了生存契机，促使基因缺陷的积累和细胞的恶性转化，最终导致疾病的发生和发展［5］。凋亡抑制蛋白是细胞周期终末效应阶段的重要调节因子，其家族的新成员suvivin能直接抑制caspase3和caspase7的活性，阻断细胞的凋亡过程［5］。与其他iap家族成员不同的是，survivin在组织分布上具有明显的细胞选择性，通常只表达胚胎和发育的胎儿组织，除胸腺外不见于其他正常终末分化的成人组织，而大多数肿瘤组织内均可见survivin的表达［6］。
sarela等［2］发现，在59例大肠癌中有37例患者表达survivin基因，而且这些患者的5年生存率远远低于表达阴性者(44.8% vs 94.4%)，而在乳腺癌和肺癌中也有类似的报道［3,7］。adida等［4，8］用免疫组织化学的方法检测时发现，在弥漫性大b细胞淋巴瘤中有60%患者表达survivin基因，而在125例aml患者中同样有60% survivin表达阳性。在本研究中，我们用rtpcr的方法检测了37例不同类型的初治白血病患者survivin的表达情况。结果发现，37例白血病患者骨髓中有25例表达survivin mrna表达，阳性率为67.6%，其中急性淋巴细胞白血病(all)细胞中survivin mrna表达阳性率为73.3%，较急性髓系白血病(aml)的63.6%稍高，结果同国外学者报道一致。另外，我们还发现在多种人类白血病细胞系中同样存在survivin的表达。
最近，有学者研究发现，给与生长因子刺激可以使内皮细胞中survivin和xiap的表达水平增高，诱导抗凋亡基因的表达，从而降低对凋亡刺激的敏感性［9，10］。在本实验中，我们发现给与合适浓度的gmcsf(mtt法筛选，数据另文报道)刺激后， hl60细胞中survivin的mrna和蛋白表达水平明显升高，从而证明了在白血病细胞中给与生长因子刺激同样可以引起survivin的表达增高，降低对凋亡刺激的敏感性。这很可能是白血病细胞发生免疫逃逸而避免凋亡的重要机制之一，这一结果对临床上的治疗有着极其重要的意义。另外，已证实bcl2在肿瘤细胞凋亡中发挥着重要的作用，某些刺激因子在诱导bcl2基因表达增高的同时能引起survivin的表达增高。由此可见，survivin和bcl2之间很可能有协同作用，共同抑制细胞的凋亡，参与肿瘤的发生。
以上的研究结果表明，survivin在白血病细胞中表达明显升高， 它通过干扰肿瘤细胞凋亡和增殖平衡促进白血病的发生发展。因而，对survivin基因的作用机制和功能的进一步研究，将有益于更清楚的了解白血病的发生机制，并对临床治疗产生重要的影响。
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