【摘要】 比较正常妊娠与脂多糖(lps)诱导流产小鼠模型蜕膜组织肿瘤坏死因子α(tnfα)及核转录因子kppab(nfκb)的表达。方法：建立正常妊娠模型和lps诱导流产模型。采用sabc法测定两组模型孕鼠13d蜕膜组织tnfα和nfκb的表达水平。结果：lps诱导流产模型蜕膜组织tnfα和nfκb的表达明显高于正常妊娠模型(p<0.01)。结论：nfκb异常表达可能是小鼠流产的重要因素。
【关键词】 蜕膜组织; 肿瘤坏死因子α(tnfα);核转录因子kppab(nfκb);流产;小鼠
近年研究表明,不明原因的自然流产与母体肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,tnfα)的表达水平升高有关[1,2]，tnfα能直接引起实验动物的胎盘出血。核转录因子kppab(nfκb)是一种快速反应的转录调节因子，几乎存在于所有细胞中，能调控许多趋化因子、粘附因子、生长因子等细胞因子(包括tnfα)的生成，是基因发挥作用必须通过的基因开关[3，4]。蜕膜组织是母体与胎儿直接接触的界面，蜕膜组织对胎儿的免疫耐受为维持妊娠所必需。本文通过比较正常妊娠与流产小鼠模型蜕膜组织tnfα和nfκb的表达水平，旨在探讨二者在流产中的意义与作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 雌性(未经产)、雄性昆明小鼠各20只，10～12周龄，由长江大学实验动物中心提供。wwW.11665.CoM
1.1.2 试剂与仪器 兔抗鼠nfκb多克隆抗体、兔抗鼠tnfα多克隆抗体、即用型链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物(sabc)试剂盒、二氨基联苯胺(dab)显色试剂盒、枸橼酸盐抗原修复液(0.01mol/l，ph6.0)由武汉博士德公司提供。脂多糖(lps)为美国sigma公司产品。切片机(leica rm 2135，上海莱卡仪器有限公司)，光学显微镜(nikon eclipse e800, 日本nikon)，显微摄像系统(spot version3.5, diagnostic instruments inc, usa), 图像分析系统(imagepro plus version 5.0.2，media cyberntics inc, usa)。
1.2 方法
1.2.1 建立小鼠模型及处理 小鼠常规饲养，自由采食饮水。日光照12h。经适应环境1周后，阴道涂片法进行发情鉴定。发情母鼠与公鼠1∶1合笼过夜，次日清晨检出阴栓者定为孕0d。将受孕雌性小鼠随机分为流产组和正常妊娠组，每组10只。流产组母鼠在孕7d尾静脉注入lps 0.1μg(0.2ml)。正常妊娠组母鼠注入磷酸缓冲液(pbs)0.2ml。于妊娠第13天处死孕鼠，取胎盘计算胚胎吸收率(r)以评价模型建立成功与否。r=[re/(re+f)]×100%，re为吸收胚胎数, f为存活胚胎数。吸收的胚胎个体小，颜色紫黑，出血坏死，有的已溶化为血团块;解剖镜下观察模糊一片，没有胎膜结构。存活胚胎个体较大，粉红色;镜下观察胎膜及胎儿轮廓清晰，透光度好，无出血，淤血现象。
1.2.2 标本处理 在孕第13天处死两组模型鼠，采集蜕膜组织(采集的组织均来自于吸收胚胎邻近的正常存活胚胎)。将蜕膜组织用生理盐水漂洗去掉血液后，用10 %中性甲醛固定24h，石蜡包埋,连续切片，每张厚约5μm。置60℃烤箱，72h烘干后备用。1.2.3 免疫组化sabc染色与观察 按常规程序操作，tnfα和nfκb一抗工作液的浓度分别为1∶100和1∶100, dab为显色剂。用已知的tnfα阳性slca切片和nfκb阳性切片作阳性对照，用pbs代一抗作为阴性对照。结果判定：细胞胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。按阳性细胞所占的百分比分为4级：阴性()表现为不着色;弱阳性()表现为浅黄色;中度阳性()表现为深黄色;强阳性()表现为棕黄色。
1.3 统计学处理 采用spss13.0系统软件包，计数资料组间比较采用χ2检验。p<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 两组孕鼠的胚胎吸收率比较 lps诱导流产模型孕鼠的胚胎吸收率明显高于正常妊娠模型，两组比较差异有统计学意义(p<0.01)。见表1。表1 两组孕鼠胚胎吸收率比较注：两组间比较，*p<0.01。
2.2 tnfα的表达状况 tnfα主要表达于正常子宫内膜、流产子宫内膜的腺上皮细胞胞浆和胞膜。从表2可以看出，流产小鼠子宫内膜比正常妊娠小鼠子宫内膜的tnfα显著升高。
2.3 nfκb的表达状况 nfκb主要表达于正常子宫内膜(见第92页彩色图版ⅵ之图1)、流产子宫内膜(见第92页彩色图版ⅵ之图2)的蜕膜细胞胞浆，少数胞核中也有表达，在内膜的血管内皮细胞中亦有表达。从表3可以看出，流产小鼠子宫内膜比正常妊娠小鼠子宫内膜的nfκb显著升高。表2 两组母鼠子宫内膜tnfα的表达状况表3 两组母鼠子宫内膜nfκb的表达
3 讨 论
3.1 tnfα与流产的关系 国外学者发现，流产率高的孕鼠胎盘中tnfα表达显著高于对照组，在蜕膜中有过量的tnfα表达，且当母胎界面tnfα表达下降时孕鼠流产率也随之下降[5，6]。妊娠期适量的tnfα能促进妇女能量代谢及胚胎发育，提高孕激素及绒毛膜促性腺激素的合成，并刺激细胞滋养层生成尿激酶型血浆素原激活剂(upa)，有利于蜕膜细胞外基质降解及胎盘植入，对妊娠维持有重要作用[7，8]。当母体免疫功能异常或某些因素使巨噬细胞等被激活，均可造成tnfα水平升高，高浓度的tnfα可能通过多种途径导致流产：激发th1型免疫反应，排斥胚胎组织;促进滋养细胞凋亡;提高前列腺素e2的合成，兴奋子宫平滑肌引起宫缩;上调促凝血酶原激酶12(fg12)表达，导致胎盘滋养层血管血栓形成，最终影响绒毛正常发育，出现绒毛滋养细胞(尤其是合体滋养细胞)凋亡增加，直接破坏胎盘屏障的完整性及功能，导致流产的发生[7，8]。本文结果显示，lps诱导流产模型组孕鼠(胚胎吸收率25.81% )蜕膜组织tnfα表达明显高于正常妊娠模型组(胚胎吸收率8.75% )(p<0. 01)，这与国外的研究结果相符。
3.2 nfκb与流产的关系 核转录因子kppab是一种广泛存在的多效性的核转录因子，为rel蛋白家族成员，由多肽p50和p65亚基形成同源或异源性二聚体。在静息细胞中，nfκb主要位于细胞浆，与具有抑制作用的iкb家族结合，其锚蛋白重复序列掩盖了nfκb的dna结合位点而干扰nfκb的功能。可被多种刺激因子如脂多糖、tnfa、ill、病毒、自由基及紫外线等激活，调节趋化因子、生长因子、粘附分子、免疫受体、应激相关酶及急性期蛋白等[911]的功能。通过调控靶基因表达产物，nfκb信号通道参与了感染、炎症、免疫反应、细胞凋亡和肿瘤等病程及细胞周期调控与细胞分化等[12，13]。研究表明nfκb在多种炎症疾病中均存在着活化现象[14]，调控众多炎症性细胞因子mrna的表达[15]。nfκb在激活后可使ill、tnf mrna的水平上调，而ill、tnfa与流产的关系密切。本文结果显示，lps诱导流产模型组孕鼠蜕膜组织nfκb表达明显高于正常妊娠模型组(p<0. 01)，表明nfκb参与了流产过程。可能是nfκb引起炎性细胞增加，胎盘滋养细胞异常凋亡增加，子宫螺旋小动脉急性粥样硬化，胎盘出血、坏死增加等一系列病理反应，最终导致流产;nfκb亦可通过增加tnfa的表达而导致流产。有临床研究证实，nfκb在早期流产患者的绒毛组织中表达也增高[16]。
长江大学学报(自然科学版)2009年12月综上所述，tnfα及nfκb参与了流产过程，但tnfα及nfκb对生殖过程各个环节的调节机理尚有待于进一步研究。
【参考文献】
1]clar da，justin m，lydia l，at al.ecology of dangerdependentcytokineboosted spontaneous abortion in the cba×dba/2 mouse model[j].am j reprod immunol，2004,52(6):370378.
[2]toder v，fein a，carp h，at al.tnfαin prognancy loss and embryo maldevelopment:a mediator of detrimental stimuli or a protector of the fetoplacental unit[j]. assisted reproduction and genetics，2003,20(2):7381.
[3]bours v，dejardin e. the nfkappab transeription factor and cancer .high expression of nfkappab and 1kappab elated proteins in tumor cell lines[j]. bioehem phamcol，1994，47(1):145152.
[4]huang s，pettaway ca，uehara h，at al.bloekadeof nf.kappab activeity inhuman prostate cancer cells is associated with suppression of angiogenesis invasion and inetastasis[j].2001，20(31):41884196.
[5]torchinsky a， markert ur， toder v. tnfalphamediated stressinduced early pregnancy loss: a possible role of leukemia inhibitory factor[j]. chem immunolallergy，2005，89(8): 6271.
[6]berman j， girardi g， salmon g. tnfalpha is a critical effector and a target for therapy in antiphospholipid antibody induced pregnancyloss[j]. j immunol，2005，174(1): 485490.
[7]idriss ht， naismith jh. tnfalpha and the tnf receptor superfamily: structure function relationship[j]. int gynecol obstet，2005，88(1): 4448.
[8]monz bo，vadillo or. modulation of trophoblast function by tumor necrosis factoralpha: a role in pregnancy establishment andmaintenance [j]. am j obstet gynecol，2002，187(6): 15741580.
[9]grumont rj，gerondakis s. rel induces interferon regulatory factor4(irf4)expression in lymphocytes: modulation of interferonregulated gene expression by rel/nuclear factor kappab[j]. expmed，2000，1919(8):12811292.
[10] chen f，castranova v，shi x，at al.new insights into the role of nuclear factorkb， a ubiquitous transcription factor in the initiation of disease[j]. clin chem，1999，45(1):117.
