作者：樊慧杰 康慧芳 姚建强 王晓媛 杨利军 牛勃
【摘要】 ：目的 研究地龙体内两种新型脱氧核糖核酸酶(lds)的部分生化性质,并对其作用进行初步探索。方法 采用sephacryl-200柱层析、毛细管等电聚焦电泳法、琼脂糖凝胶电泳等方法。结果 初步得出ld1、ld2分子量为126、62 kda；确定了等电点分别为6.12、6.05。ld1、ld2对细菌质粒dna、λdna均有分解作用。结论 地龙中的lds是一种新型的脱氧核糖核酸酶。明确lds的分子量、等电点有助于优化lds的提取工艺以及lds的进一步研究。对细菌质粒dna、λdna的降解提示lds有可能对抗细菌的耐药性。
【关键词】 地龙 脱氧核糖核酸酶 分子量 等电点
abstract：objective to study partial biochemical characterization and effect of lumbricus dornases (lds). methods sephacryl-200 column chromatography, cief and agarose electrophoresis were used to determine lds. results the molecular weights of ld1 and ld2 were 126 kda and 62 kda respectively. the pi of ld1 and ld2 were 6.12 and 6.05. lds degraded bacterial plasmid and λdna. conclusion lds is a new kind of dornases. the determination of molecular weights and pi of lds will help their further study. the results of plasmid and λdna degradation imply that lds can oppose bacteria drug resistance.
key words：lumbricus；dornases；molecular weight；pi
地龙,又名蚯蚓,属无脊椎动物,环节动物门,寡毛纲。wWW.11665.com地龙性寒味咸,功能清热平肝、熄风止痉、平喘、利尿、通络除痹。主治高热烦躁、惊厥抽搐、肺热喘咳、热结尿闭以及疮疡脓毒等症。国内外研究已发现,蚯蚓体内有溶栓酶、蚓激酶、胆碱酯酶、过氧化氢酶[1]、溶菌酶[2]、lysenin[3]等有效成分。作为有4 000余年药用历史的地龙,对其开发利用还是远远不够。本课题组致力于地龙的研究,从地龙中分离纯化出脱氧核糖核酸酶样的物质(lds)。本实验主要研究lds分子量、等电点,并对其作用进行初步探索。证实lds为新型的脱氧核糖核酸酶,具有不同的性质。同时为lds的研究开发提供可靠的实验依据。
1 实验材料
1.1 样品与试剂
分离、纯化的ld1、ld2。蓝色葡聚糖2000(blue dextran- 2000),pharmacia；coomassie brilliant blue g250, fluka；毛细管等电聚焦试剂盒(cief3-10 kit)；质粒(pbv220),由本实验室自备；λdna,sigma公司产品。其它所用试剂均为分析纯。
1.2 主要仪器
gradifrac v1.2层析系统,pharamacia公司；毛细管电泳仪：beckman 55002。
2 实验方法
2.1 分子量测定
凝胶过滤层析(分子筛)法：参照文献[4]方法。
2.2 等电点测定
毛细管等电聚焦电泳法：参照文献[5]方法。
2.3 lds对质粒的降解作用
取3 μl质粒(pbv220),分别加入ld1、ld2 10 μl,37 ℃反应30 min后进行0.8% 琼脂糖凝胶电泳,eb染色后分析结果。
2.4 lds对λdna的降解作用
取2 μlλdna,分别加入ld1、ld2 10 μl,37 ℃反应30 min后进行0.8% 琼脂糖凝胶电泳,eb染色后分析结果。
3 结果
3.1 凝胶过滤层析(分子筛)测定lds分子量
以标准蛋白质洗脱体积为纵坐标,标准蛋白质分子量的对数为横坐标,绘制标准曲线。根据ld1、ld2的洗脱体积,查标准曲线,并计算出用sephacryl s-200测得ld1、ld2分子量分别为126、62 kda。
3.2 lds等电点的测定结果
毛细管等电聚焦法测定等电点的结果：ld1、ld2等电点分别为6.12、6.05。
3.3 lds对质粒(pbv220)的降解作用(见图1)
ld1、ld2与质粒作用30 min后电泳,eb染色观察,ld1、ld2彻底降解了质粒。倍比稀释的ld1、ld2分解质粒的作用减弱,可以看到仍有微弱的质粒条带出现。lds对质粒有明显的降解作用,从图1中看不出ld1、ld2对质粒的降解作用有明显的差别。
3.4 lds对λdna的降解作用(见图2)
lds与λdna作用30 min后进行0.8% 琼脂糖凝胶电泳,eb染色后分析结果。ld1、ld2 作用后的λdna条带减弱,图2的下方有云雾状的阴影,为λdna的降解产物。说明ld1、ld2有降解λdna的作用。图2中看不出ld1、ld2对λdna降解作用有明显的差别。
4 讨论
脱氧核糖核酸酶(dnase)已在不同的物种中发现,目前针对其研究较多的是dnaseⅰ、dnaseⅱ。dnaseⅰ是sachs[6]1905年首次在牛胰腺中发现,现对dnaseⅰ的研究已扩展到人、鸡、鼠、犬及鲤鱼等动物。已纯化出不同来源的dnaseⅰ的分子量在32～41 kda范围之间,等电点在3.9～4.7之间。dnaseⅱ存在于各种哺乳动物的组织中[7],尽管来自各种不同种属和组织的dnaseⅱ的化学性质并不完全一样(如分子量、亚基结构),但这些酶的酶学性质非常相似。迄今已纯化出不同来源的dnaseⅱ的分子量范围在26.5～45 kda之间。我们发现的ld1、ld2分子量为126、62 kda；等电点为6.12、6.05。lds与dnaseⅰ、dnaseⅱ分子量有很大差别,分子量远远大于dnaseⅰ、dnaseⅱ；lds的等电点也明显不同于dnaseⅰ。可以推测,lds是新型的脱氧核糖核酸酶,具有不同的性质。
质粒是细菌染色体以外能自主复制的,双链共价闭合环状dna。细菌对药物产生抗性,原因多种。现在研究的热点是耐药性质粒(其携带耐药基因),质粒可以从一个细菌进入另一个细菌,耐药基因也从一个细菌传到另一个细菌,致细菌耐药性的广泛产生。噬菌体是感染细菌的一类病毒,有的噬菌体基因组较大,如λ噬菌体和t噬菌体。λ噬菌体由外壳蛋白和λdna(线状双链dna分子)组成。通过溶原性方式λdna能整合到细菌染色体dna中,与λdna相毗邻的细菌基因有可能被噬菌体从一个细胞转移到另一个细胞(即转导),使遗传性状在不同细菌个体间传播。本实验表明,lds能降解耐药质粒和λdna,推测lds有可能阻断细菌遗传形状的改变(如细菌的耐药性)。lds彻底降解了质粒,同样条件下对λdna是部分分解。λdna为48 502 bp,远远大于质粒(pbv220：3 665 bp),lds降解λdna较质粒会困难些。
在临床上重组人dnase(rhdnase)已用于治疗支气管扩张、肺脓疡等。现认为重组人dnase可以分解黏液中的dna,减轻炎症从而发挥作用[8]。提示作为一种新脱氧核糖核酸酶的lds同样有可能对抗炎症,起到治疗作用。
lds是新蛋白质,是蚯蚓开发的新思路。本实验研究了lds的部分性质,为lds的深入实验及开发利用做了铺垫。lds的研究可以为地龙治疗肺热喘咳、热结尿闭以及疮疡脓毒等症提供理论依据。
【参考文献】
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