作者：杨展 ，赵家明 ，王旭光, 吴平，何惠娟，杨勤
【摘要】 目的： 探讨cmyc脱氧核酶的切割作用及对白血病细胞端粒酶活性的 影响 . 方法 ： 合成针对cmyc mrna的“10～23”型脱氧核酶dzmyci及其类似物dzmyci提取总rna在细胞外切割cmyc mrna；转染白血病细胞系hl60后，用rtpcr扩增cmyc基因片段和端粒酶蛋白亚基htert的片段，用pcrelisa法测定端粒酶活性. 结果： 脱氧核酶dzmyci在细胞外和细胞内均能够有效地切割cmyc mrna；在转染hl60后，dzmyci显著抑制白血病细胞生长(p<0.05)，下调端粒酶蛋白亚基htert的表达，显著降低hl60细胞端粒酶活性(p<0.05). dzmyci催化中心的一个碱基被替换后形成的脱氧寡核苷酸dzmyci在胞外和胞内均不表现对cmyc mrna的切割作用. 结论： 脱氧核酶dzmyci确实能够高效特异地切割cmyc mrna，降低白血病细胞端粒酶活性，抑制白血病细胞生长，有可能作为cmyc抑制剂用于白血病的基因 治疗 领域中.
【关键词】 催化性dna；原癌基因蛋白质cmyc；端粒酶；白血病
【abstract】aim： to explore the cleavage of cmyc mrna by a dnazyme and its effect on telomerase activity in a human leukemia cell line hl60.methods： a “1023” dnazyme(dzmyci) targeted against cmyc mrna and its analogues(dzmyci) were synthesized and used to cleave cmyc mrna. the cleaving efficiency and the expression of human telomerase reverse transcriptase(htert) was assessed by rtpcr and telomerase activity was assayed by pcrelisa. results： dzmyci exhibited effective cleaving ability and after transfection into hl60 cells, downregulated the htert expression and telomerase activity(p<0.01), and inhibited the growth of the cells(p<0.05). dzmyci, which was derived from dzmyci with a base displacement in the conserved catalytic motif, did not exhibit notable cleaving effect on cmyc mrna either outside the cells or in cells. conclusion： the synthesized dnazyme dzmyci can cleave cmyc mrna with effectiveness and specificity, decrease the telomerase activity and induce the apoptosis of hl60 cells. as newly found cmyc inhibitors, dnazymes will probably play an important role in the gene therapy of leukemia.
【keywords】 dna, catalytic; cmyc; telomerase; leukemia
0 引言
脱氧核酶(deoxyribozyme，dnazyme)是具有酶活性的单链小dna分子，能够特异切割靶rna分子［1］. cmyc基因的异常扩增和表达、端粒酶活性的升高与许多恶性肿瘤的发生有关，抑制这两个基因的表达能够促进恶性肿瘤的凋亡［2-6］. 本文通过合成针对人cmyc基因的脱氧核酶，在白血病细胞内和细胞外切割cmyc mrna，并观察其对细胞生长和端粒酶活性的影响， 研究 利用脱氧核酶抑制cmyc表达来进行白血病基因治疗的可能性.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞及培养条件 人白血病细胞系hl60由上海细胞所提供，用含有100 ml/l新生牛血清、100 ku/l青霉素g和0.1 g/l卡那霉素的rpmi1640培养液在37℃，50 ml/l co2的培养箱中培养.
1.1.2 脱氧核酶dzmyci及其类似物dzmyci 合成自oligos etc公司，序列如下：dzmyci：5′tgaggg gcaggctagctacaacgacgtcgcggi3′(gi表示倒位连接的g碱基)dzmyci：5′tgaggggcaggctagctacaaccacgtcgcggi3′(将dzmyci第23位g改为c)dzmyci为经过3′修饰的脱氧核酶，中间的ggctagctacaacga为脱氧核酶的催化核心，其两端序列为底物结合区，分别与cmyc mrna的起始密码子aug两旁序列互补，切割位点在起始密码子的a与u碱基之间. 脱氧核酶的3′端两个g碱基通过3′3′磷酸二酯键相连接(倒位连接，3′inversion)［7］. dzmyci由dzmyci的第23位g改为c而成.
1.1.3 pcr引物 合成自上海生工生物公司. 序列如下：gapdh：(+)5′ctgcaccacc aactgcttag3′；(-)5′tgaagtcagaggagaccacc3′. 扩增片段长度为407 bp. cmyc：(+)5′cgggtagtggaaaaccagcag3′；(-)5′tgtgaccgcaacgtaggaggg3′. 扩增片段长度为267 bp. 上下游引物分别在dzmyci切割位点的两侧. htert：(+)5′cgaagtctgcc gttgcccaaga3′；(-)5′tcgcctgaggagtagaggaagtg3′. 扩增片段长度为323 bp.
1.1.4 试剂 rpmi1640，rna提取试剂trizol，逆转录试剂盒购自introvigen公司，端粒酶活性测定试剂盒购自宝灵曼公司，其他主要试剂除了在文中标明的以外，均为国产试剂.
1.2 方法
1.2.1 脱氧核酶的体外切割作用 ①细胞总rna的提取：用含有100 ml/l血清的培养液培养细胞至70%融合期，收集细胞，采用trizol试剂抽提总rna，定量. ②cmyc mrna的细胞外切割反应［8］：10 μl的反应体系中含有10 μg总rna、10 μmol/l的dzmyci或dzmyci，50 mmol/l的trishcl(ph7.4)和10 mmol/l的mgcl2，37℃反应1 h或2 h. ③逆转录聚合酶链反应(rtpcr)和琼脂糖凝胶电泳：针对脱氧核酶切割后的总rna，用逆转录试剂盒合成cdna第一链，取出2 μl进行pcr. gapdh与cmyc的扩增条件为94℃ 4 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，32个循环，72℃ 7 min. pcr产物用15 g/l琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统成像.
1.2.2脱氧核酶的胞内切割作用及对htert表达和端粒酶活性的影响 ①脱氧核酶的转染［9］：将半融合期的细胞在不含血清的培养液中孵育6 h，接着用0.05，0.1 μmol/l的dzmyci或dzmyci在superfect试剂(qiagen)介导下(按照试剂盒说明进行)分别转染细胞(对照为superfect空载体). 在第1次换不含血清的培养液后24 h，用ph7.4的pbs洗细胞，换上含有50 ml/l血清的新培养液进行第2次转染. 在转染后48 h用台盼蓝进行活细胞计数(每种处理重复4次). ②cmyc和htert的rtpcr扩增：在第2次转染后细胞用含50 ml/l血清的培养液培养36 h，收集细胞，采用trizol试剂提取总rna，定量. cmyc和相应的gapdh扩增条件同上. htert与对应的gapdh同管扩增，条件为预变性94℃ 3 min，94℃ 40 s，59℃ 40 s，72℃ 1 min 7个循环，94℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 1 min 25个循环，72℃延伸5 min. pcr产物用15 g/l琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统成像. ③端粒酶活性测定：在第2次转染后细胞用含50 ml/l血清的培养液培养36 h，离心收集5×105个细胞，加入50 μl 裂解液充分混匀，冰浴30 min，16000 g离心20 min，收集上清. 取裂解上清3 μl，pcr反应混合液25 μl，depc处理的水22 μl于pcr反应管中充分混匀，加入石蜡油后置于pcr仪进行反应. 首先在25℃孵育30 min，经94℃灭活5 min进入pcr循环：94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，32个循环，72℃延伸10 min后终止反应. 取5 μl pcr反应产物加20 μl变性液室温放置10 min，然后加入225 μl杂交液混匀，吸取100 μl加入到亲和素包被的反应孔中，于37℃ 300 r/min振荡2 h，弃去液体用洗液洗3次，加100 μl过氧化物酶标记的抗地高辛抗体于37℃ 300 r/min反应30 min，弃去液体，以洗液洗5次，加入100 μl四甲基联苯胺显色液室温20 min，加入100 μl终止液终止反应，于30 min内用酶标仪测定450 nm和655 nm处的吸光度值. 以二者之差δa(a450 nma655 nm)作为端粒酶活性值.
统计学处理：多组比较采用方差 分析 (anova)，组与组之间两两比较采用q检验.
2 结果
2.1 脱氧核酶对cmyc mrna的细胞外切割反应 脱氧核酶类似物dzmyci处理细胞总rna，与未经处理的对照相比，cmyc的pcr扩增片段产量没有明显变化. 然而脱氧核酶dzmyci处理总rna后，cmyc的pcr扩增片段产量显著减少，这说明脱氧核酶dzmyci能够有效切割cmyc mrna(图1).
m：marker; 1：对照组(未经脱氧核酶或其类似物处理)；2：dzmyci组(1 h)；3：dzmyci组(2 h)；4：dzmyci组(2 h).
图1 脱氧核酶在体外切割cmyc mrna后对其进行rtpcr扩增（略）
2.2 脱氧核酶对hl60细胞内cmyc mrna的切割作用 与空载体转染相比，dzmyci转染后cmyc扩增片段产量没有明显变化，dzmyci转染后扩增片段产量减少，并呈剂量依赖性，这说明脱氧核酶dzmyci转染hl60细胞后能够有效地切割细胞内cmyc mrna(图2).
m：marker; 1：对照组；2：dzmyci组(0.05 μmol/l)；3：dzmyci组(0.1 μmol/l)；4：dzmyci组(0.1 μmol/l).
图2脱氧核酶转染对cmyc mrna水平的 影响 （略）
2.3 脱氧核酶的转染对hl60细胞生长的影响 与对照相比，脱氧核酶类似物dzmyci转染后对hl60细胞生长没有明显的影响(p>0.05)，0.05 μmol/l脱氧核酶dzmyci转染后细胞数量略微下降(p>0.05)，0.1 μmol/l dzmyci转染后的细胞数量明显减少(p<0.02, 表1).
表1 脱氧核酶的转染对hl60细胞生长和端粒酶的影响（略）
ap<0.05 vs a, d.
2.4 脱氧核酶转染对hl60细胞端粒酶活性和端粒酶亚基htert基因表达的影响 dzmyci转染与空载体转染相比，端粒酶活性和htert表达没有明显的差异(p>0.05)；dzmyci转染后的端粒酶活性和htert表达，有显著的下降(p<0.01)，并呈剂量依赖性. 这说明脱氧核酶dzmyci转染能够显著地抑制hl60细胞htert表达和端粒酶活性(表1，图3).
m：marker;1：对照组；2：dzmyci组(0.05 μmol/l)；3：dzmyci组(0.1 μmol/l)；4：dzmyci组(0.1 μmol/l).
图3 脱氧核酶转染对htert mrna水平的影响（略）
3 讨论
cmyc是一种与肿瘤 发展 高度相关的转录因子，在许多恶性肿瘤中发生突变或异常表达. 降低或阻断cmyc的过表达，能够抑制肿瘤细胞的生长并促使其凋亡. 抑制cmyc基因表达的 方法 很多，例如反义rna、rna干扰、核酶和肽核酸等. 1994年以来人们利用体外分子进化技术(selex技术)［10］，合成了多种具有酶活性的脱氧寡核苷酸（脱氧核酶）. 其中santoro发现的"10～23"型脱氧核酶，能够特异切割各种rna，特别是能够在mrna的起始密码子aug处特异切割大多数mrna，非常适于基因表达抑制的 研究 ［1］.
sun等［7］合成了多个针对人cmyc mrna起始密码子的脱氧核酶，能够在细胞外和细胞内有效切割平滑肌细胞cmyc mrna，并抑制细胞增殖. 其中编号为rs6的脱氧核酶在3′末端添加了一个倒位连接的g碱基，不仅表现出最大的切割效率，而且能够有效抵抗核酸酶的降解. 本文利用该脱氧核酶(即dzmyci)在细胞外处理白血病细胞总rna，然后转染进入白血病细胞内，通过rtpcr检测cmyc mrna水平，显示dzmyci能够降低cmyc mrna水平，并能抑制白血病细胞增殖. 将dzmyci活性中心的一个g替换为c形成的dzmyci却不能在胞内和胞外降低cmyc mrna水平和抑制白血病细胞增殖. 这表明dzmyci确实具有rna切割酶活性，而dzmyci不具备rna切割酶活性，替换位点对脱氧核酶的活性是至关重要的［1,7］；也表明dzmyci抑制白血病细胞增殖完全是由其rna切割酶活性引起，而不是作为反义核酸起作用的.
端粒酶是合成染色体端粒dna的一种逆转录酶，由一个rna分子(端粒酶rna，tr)和一个蛋白亚基(tert)组成. 绝大多数恶性肿瘤表达端粒酶活性. 用针对cmyc的脱氧核酶dzmyci转染白血病细胞，检测人的端粒酶蛋白亚基(htert)基因表达情况和端粒酶活性情况. 结果表明dzmyci能够下调htert表达和端粒酶的活性. 一般认为端粒酶的rna组分在细胞内组成性表达，端粒酶活性调节主要决定于蛋白亚基的表达. 从本文的研究结果推测，dzmyci可能首先降低细胞内cmyc蛋白的水平，进而下调htert的表达，导致细胞端粒酶活性的降低，抑制白血病细胞的增殖，促进其凋亡［6］.
cmyc脱氧核酶与其他cmyc抑制剂，如干扰性rna、核酶等相比，具有分子小、合成方便、抑制效率高、性质稳定等优点，在白血病等恶性肿瘤的基因 治疗 领域可能具有很好的临床 应用 前景.
【 参考 文献 】
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