【摘要】 目的 建立高效液相色谱法测定利咽颗粒中绿原酸含量的方法。方法 色谱柱为diamondsil cl8(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.4%磷酸(13∶87),检测波长327 nm,流速1.0 ml/min。结果 线性范围为0.026～0.26 μg(r＝0.999 9),平均回收率为101.84%,rsd＝0.48%(n＝6)。结论 该法简便、准确、稳定,可用于利咽颗粒的质量控制。
【关键词】 高效液相色谱法；利咽颗粒；绿原酸；含量测定
abstract：objective to establish a hplc method for determination of chlorogenic acid in liyan granule. method the determination was performed on diamondsil cl8 (4.6 mm×150 mm, 5 μm) with mobile phase consisted of acetonitrile-0.4% phosphonic acid solution (13∶87) at a flow rate of 1.0 ml/min. the detective wavelength was set at 327 nm. result the linear range of chlorogenic acid was 0.026～0.26 μg (r＝0.999 9) and the average recovery rate of chlorogenic acid was 101.84% (rsd＝0.48%, n＝6). conclusion this method is simple, accurate and with good stabilization, and suitable for the quality control of liyan gramule.
key words：hplc；liyan granule；chlorogenic acid；content determination
利咽颗粒由金银花、玄参、薄荷(油)、桔梗等9味中药组成,具有宣肺利咽、清热解毒之功效。WwW.11665.com金银花为处方中的君药,用量最大,其主要成分为绿原酸。测定绿原酸的含量能够反映和控制该制剂的内在质量[1-3]。本试验采用高效液相色谱(hplc)法测定利咽颗粒中绿原酸的含量,方法快速简便、稳定可靠、专属性强,为控制利咽颗粒的质量标准提供了可借鉴的依据。
1 仪器与试药
岛津lc-10a高效液相色谱仪,岛津spd-10a紫外检测器,kq-250db型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号753- 200413,供含量测定用)；利咽颗粒(杭州华东医药集团生产,批号080801、080802、080803)。磷酸为分析纯,甲醇和乙腈为色谱纯,水为重蒸水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：diamondsil cl8(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液(13∶87)；流速：1.0 ml/min；检测波长：327 nm；柱温：室温。进样量：10 μl。在此色谱条件下,绿原酸的保留时间约8 min,理论塔板数按绿原酸计算均不低于2 000。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取绿原酸对照品约5.2 mg,置100 ml量瓶中,加50%甲醇适量,超声波处理l0 min,再加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜(0.45 μm)滤过,即得。
2.2.2 供试品溶液的制备
精密称取本品约0.5 g,置于50 ml量瓶中,加入50%甲醇至刻度,密塞,称定重量,放置4 h(避光),超声(250 w,40 khz)处理40 min,放冷,称重,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,即得。
2.2.3 阴性对照溶液的制备
按样品处方量制备不含金银花药材的利咽颗粒,按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。
2.3 干扰性试验
分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液,在上述色谱条件下进样10 μl,分别进行测定,记录色谱图。结果供试品溶液及对照品溶液在相同保留时间处有吸收峰,阴性对照在相应位置无吸收峰,样品中绿原酸峰与其他峰完全分离,分离度较好,阴性对照溶液对绿原酸测定无干扰,结果见图1。
2.4 线性关系考察
精密吸取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml,置10 ml量瓶中,以50%甲醇稀释至刻度,摇匀,分别精密吸取上述稀释液及对照品溶液10 μl,在上述色谱条件下依法测定峰面积,以峰面积为纵坐标,绿原酸对照品进样量为横坐标,得回归方程：y＝12 637.79x－2.74,r＝0.999 9(n＝6),结果表明,绿原酸进样量在0.026～0.26 μg范围内具有良好的线性关系。
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液(0.052 mg/ml)10 μl,连续进样6次,记录峰面积,rsd＝0.55%(n＝6),结果表明精密度良好。
2.6 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液10 μl,l2 h内每隔一定时间测定1次,记录峰面积,rsd＝1.09%(n＝6),表明供试品溶液在室温条件下12 h内稳定。
2.7 重复性试验
取同批样品5份,分别依法平行操作,测定每份样品中绿原酸含量,结果平均值为0.278 mg/g,rsd＝1.57%(n＝5),表明本法重复性良好。
2.8 加样回收率试验
精密量取已知含量的同一批样品6份,精密加入一定量的绿原酸对照品,按本法进行含量测定并计算回收率,平均回收率为101.84%,rsd＝0.48%(n＝6)。结果见表1。表1 加样回收率试验结果(略)
2.9 样品含量测定
取3批样品,分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各l0 μl,按上述色谱条件测定,每批样品平行测定3次,按外标法计算绿原酸的含量,结果见表2。表2 样品含量测定结果(略)
3 讨论
绿原酸为含有羟基和邻二酚羟基的弱有机酸,易溶于水和甲醇。由于样品中其他成分的互相影响,在供试液制备时,曾分别用了2种不同溶剂进行考察：以甲醇为溶剂,溶液出现混浊,沉淀较多；以50%甲醇溶液为溶剂,溶液澄清均一,操作既简单直接,又可保证待测成分不损失,结果精密度较为满意,故采用50%甲醇溶液为本试验供试液制备的溶剂。当流动相的配比为乙腈-0.4%磷酸(13∶87)时,绿原酸峰与相邻杂质峰达到基线分离,分离度＞1.5,表明色谱系统良好。
本法操作简便,测定结果准确可靠,为利咽颗粒质量标准的完善提供了可借鉴的依据。
【参考文献】
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