作者：王菊香，郑海萍，裴士庚，门金娥，张向阳
【摘要】 目的探讨蜂胶对喉癌细胞珠ｈep-2凋亡的影响及作用机制。方法用流式细胞仪、原位末端标记法、激光共聚焦显微镜等技术，观察蜂胶对细胞的抑制、凋亡情况及细胞内ca2+变化。结果蜂胶能抑制hep-2细胞的生长、诱导喉癌细胞凋亡，非特异性地阻滞hep-2细胞周期的全过程。原位末端标记检测出细胞凋亡率亦有时间、剂量依赖性。细胞内ca2+随蜂胶浓度的增加而升高，且具有统计学意义。结论蜂胶能够抑制喉癌细胞生长，其抑制作用是通过诱导喉癌细胞凋亡而起作用的。
【关键词】 蜂胶； hep-2细胞； 细胞凋亡
目前，喉癌的治疗是以手术为主的综合治疗，化疗是其中重要的组成部分，用于喉癌的化疗药物尚缺乏理想的选择性。蜂胶是蜜蜂从植物的幼芽及树木的枝条上采集树脂类物质，与其唾液混合加工成一种芳香性胶状固体物，含有多种黄酮、槲皮素、肉桂酸衍生物、多糖、氨基酸等有药理活性的化合物［1］。它不仅具有抗病原微生物、抗氧化、抗炎、护肝等作用，还具有抗肿瘤作用。为进一步探讨其抗癌作用机理，我们观察了蜂胶对喉癌hep-2细胞凋亡的影响。现报道如下。
1 材料
1.1 蜂胶提取物取本地产蜂胶，冰冻粉碎后以95%乙醇浸泡72 h，过滤，滤液于40℃减压挥干溶剂，二甲基亚砜（dmso）溶解定容为2 mg/ml。Www.11665.CoM
1.2 试剂及仪器rpmi1640培养液为美国gibco公司产品；facscalibur流式细胞仪为美国becton dickinson公司产品；pod试剂盒购自华美生物工程公司；mrc-1024激光共聚焦显微镜（bio-rad公司产品）。
1.3 细胞株人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株由白求恩国际和平医院耳鼻喉头颈外科实验室惠赠。
2 方法
2.1 蜂胶浓度分组实验前用rpmi1640(gibco公司)将蜂胶提取物稀释成20，40，80，160 μg/ml，dmso的浓度低于0.02%。
2.2 流式细胞仪检测收集对照组和80 μg/ml蜂胶作用不同时间(24，48，72 h)的细胞，用pbs洗涤2遍，经柠檬酸缓冲液固定1 h以上，上机前加1 800 μl胰酶消化液充分作用，加入1 500 μl碘化丙啶(pi)作用15 min以上，过滤，上机进行细胞凋亡分析和细胞周期分析。
2.3 原位末端标记法(tunel)定量检测分别于各剂量药物作用后24，48，72 h收集细胞，pbs洗2次，细胞涂片，室温干燥。按原位细胞凋亡检测试剂盒说明进行操作，用普通光镜计算凋亡率(ai)。计算方法：随机选取5个高倍视野，分别计阳性细胞数及总细胞数，代入下式：ai=阳性细胞数/总细胞数×100%。
2.4 hep-2细胞内ca2+变化的激光共聚焦显微镜检测对数生长期hep-2细胞，用d-hanks液洗涤2次，于37℃避光条件下fluo-3/am（10 μmol/l）荷载。40 min后用d-hanks液洗涤细胞3次，洗去细胞外残余染料，最后保留少许细胞外d-hanks缓冲液，平衡10 min。经不同浓度蜂胶作用不同时间，在激光共聚焦显微镜下扫描细胞内荧光强度，激发波长488 nm，发射波长526 nm，以本底荧光强度为参照（0），检测细胞内ca2+荧光强度。
2.5 数据统计学处理采用spss10.0统计软件进行统计处理，计量资料用±s表示，比较时采用t检验。α=0.050。
3 结果
3.1 流式细胞仪检查结果80 μg/ml蜂胶对hep-2细胞凋亡率的影响：24，48，72 h时hep-2细胞抑制率分别为36.2%，44.5%，58.6%，时间越长细胞凋亡率越高（p<0.05）。24，48，72 h时g0/g1期细胞分别占67.2%，55.8%，59.4%；s期分别占19.1%，28.3%，33.5%；g2/m期分别占13.7%，15.9%，7.1%。
3.2 tunel标记各组细胞凋亡率明显升高，与同时间对照组比较差异有显著性，且呈现一定的时间、剂量依赖性。见表1。表1 不同浓度、不同时间蜂胶作用的
hep-2的细胞凋亡率比较（略）
与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，各时间组、各剂量组相关系数r经检验，p<0.013.3 hep-2细胞内ca2+的变化结果见表2。随药物浓度的增加，不同浓度组之间的细胞内ca2+荧光强度亦增高。p<0.05。表2 两组不同时点hep-2细胞内ca2+荧光强度比较（略）
4 讨论
蜂胶是蜜蜂从植物的幼芽及树干上采集的树脂，并混入其上腭腺分泌物、蜂蜡和少量的花粉加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。目前，已知蜂胶中所含抗癌有效成分有：黄酮类、萜烯类、多糖物质、酯类化合物等及其他化合物的天然组合，它们之间相互协调作用，赋予了蜂胶的抗癌作用［1］。实验表明，蜂胶可抑制由化学致癌物诱发的基因突变［2］。由于放疗、化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也会损伤机体的免疫活性细胞及造血细胞，因此，强化机体免疫、对抗放疗、化疗引起的副作用，是当今肿瘤防治工作重要任务之一。大量研究表明，蜂胶是一种天然的免疫强化剂，同时又兼有抗肿瘤、抗病毒、抗菌的活性［3］。本实验表明蜂胶对hep-2细胞具有明显的抑制作用，可诱导hep-2细胞凋亡，且对细胞周期有一定的影响，既可影响细胞周期g1期向s期转变，又可影响s期向g2m期的转变过程，导致肿瘤细胞凋亡，非特异性阻滞细胞周期的全过程。在此基础上，用tunel法定量观察蜂胶诱导hep-2细胞凋亡的规律。hep-2细胞有一定的自然凋亡率，但蜂胶组中的阳性细胞数明显多于对照组，且具有时间、剂量的依赖性。随着蜂胶浓度的增加，对癌细胞的杀伤作用也在增强。
ca2+信号传导在细胞凋亡机制研究中的作用日益受到人们重视。大多数细胞在凋亡过程中，细胞内ca2+均有所增加［4～6］。本实验结果显示，蜂胶作用后hep-2细胞内ca2+相对荧光强度明显高于对照组，且随着药物浓度的增高，ca2+荧光强度亦增高。提示ca2+的变化在蜂胶诱导hep-2细胞凋亡中起重要作用，可能系其诱导凋亡的关键机制之一。本实验揭示，蜂胶能够抑制喉癌细胞的生长，其抑制作用是通过凋亡机制起作用的。
【参考文献】
［1］郭芳彬.蜂胶的抗癌作用［j］.蜜蜂杂志，2003，9（1）：10.
［2］王菊香，裴士庚，门金娥，等.蜂胶乙醇提取物基因抗突变作用的研究［j］.癌变·畸变·突变，2005,17（1）:39.
［3］郭芳彬.蜂胶的抗菌作用［j］.蜜蜂杂志，2004，10（3）：10.
［4］choi yh，lee wy，nam sy，et al．apotosis induced by propolis in human hepatocelluar carcinoma cell line［j］.int j mol med,1999,4:29.
［5］mc ginnis km，wang kk，gnegy me.alterations of extracellular calcium elicit selective modes of cell death and protease activation in sh sy5y human neuroblastoma cells.［j］.j neurochem，1999，72(5)：1853.
［6］王春梅，黄晓峰，杨家骥，等. 激光扫描共聚焦显微镜技术［m］. 西安：第四军医大学出版社，2004：67.
