作者：胡送友，田登科，陈刚领，刘俊，可燕，卞卡
【摘要】 目的探讨麝香保心丸（hmp）对自发性高血压大鼠（shr）心脏保护作用及其可能的机制。方法将6 周龄shr分为hmp治疗组、高血压模型组,将wky大鼠作为正常血压组，每组分3批在3个时间点（给药6 周、给药14 周、停药9 周）处死大鼠，尾套法测定血压；frap法进行心脏组织总抗氧化能力测定；采用rt-pcr考察炎症相关因子icam-1、vcam-1、il-1β和tnfα mrna表达；western blot与elisa法分别考察炎症相关因子icam-1、vcam-1及il-1β、tnf α蛋白表达。结果hmp对shr无明显降压作用，但能提高shr心脏组织总抗氧化能力。pcr、western blot与elisa显示给予hmp 6 周和14周后，均能显著抑制shr心脏炎性相关因子icam-1、vcam-1 m rna表达及icam-1蛋白表达；给药14周后，能显著抑制炎性相关因子il-1β、tnf α mrna表达及蛋白表达；停药9周后，仍能抑制炎性相关因子icam-1、tnfαmrna表达及icam-1蛋白表达。结论hmp具有独立降压以外的对shr心脏保护作用，其机制可能与抑制心脏组织炎症反应及降低组织氧化应激有关。
【关键词】 麝香保心丸 自发性高血压大鼠 炎症 心脏 原发性高血压
abstract：objectiveto investigate the protective effect of heart-protecting musk pill (hmp) on heart in spontaneously hypertensive rats (shr), and its possible mechanisms. methods6 wk-old male shr were randomly dicided into the hmp treatment group and model. age-matched male wistar-kyoto (wky) normotensive rats were used as the control group. rats in each group were periodically decapitated in batch at three time points (6 week-treatment, 14 week-treatment, and 9 week post-treatment).systolic blood pressure(sbp) was measured by tail-cuff method. total antioxidant capacity of heart was evaluated with frap method. rt-pcr was used to measure the mrna expression of inflammation-related mediators (icam-1,vcam-1,il-1β and tnfα).the protein expression of inflammation-related mediators (icam-1,vcam-1, il-1β,tnfα) was determined by western blot and elisa.resultshmp had no marked effect on sbp, but could elevate total antioxidant capacity of heart in shr. pcr , western blot and elisa showed that hmp could inhibit icam-1,vcam-1 mrna expression and icam-1 protein expression of heart in shr after 6 weeks and 14 weeks of treatment, inhibit il-1β,tnfα mrna expression and protein expression after 14 weeks of treatment, also inhibit icam-1,tnfα mrna expression and icam-1 protein expression after 9 weeks of post-treatment. conclusionhmp has protective effect on heart independent of its hemodynamic effect on sbp. the mechanism may be associated with the suppression of inflammatory response and the decrease of oxidative stress of heart.
key words： heart-protecting musk pill; spontaneously hypertensive rats; inflammation; heart; hypertension
高血压病会引起血流动力学异常变化和血管重塑，导致心、脑、肾等靶器官损害。Www.11665.cOm心肌肥大，心肌间质纤维化及大小冠脉血管结构和功能的改变是高血压靶器官心脏的主要损害，从预后意义来讲，是最严重的并发症。降低并控制血压的同时，逆转或减轻高血压靶器官损害已成为国际上高血压病治疗的主要目标。
炎症反应不仅参与了高血压的发生发展，更是与高血压心、脑、肾等多个靶器官损害密切相关［1］。我们中心先期研究的结果也表明, 自发性高血压大鼠多个靶器官存在着明显的炎症状态存在［2］。麝香保心丸是最具代表性的治疗冠心病的有效中成药，动物实验和临床研究证明［3，4］，有抗心肌缺血、保护心肌作用，但其作用机制仍未阐明，本实验通过观察麝香保心丸对自发性高血压大鼠（shr）心脏炎症状态和氧化应激的影响，探讨麝香保心丸的心肌保护作用及其可能的机制，为其临床应用及二次开发提供新的依据。
1 器材与方法
1.1 动物与药物spf级shr 36只，wky大鼠18只，均为雄性，6周龄，由中科院上海实验动物中心提供，合格证号scxk（沪）2007-0005。麝香保心丸由上海和黄药业有限公司生产(批号g060601)。
1.2 试剂及仪器trizol rna 提取试剂均购于sigma公司；rt-pcr 试剂盒为bio-dev-tech 公司产品；引物由上海生物工程技术公司合成；抗体均购于sata cruz 公司；il-1β elisa 试剂盒（批号：rt110371）与tnfα elisa 试剂盒（批号：rt110371）均购于美国adl公司。
pcr扩增仪，德国biometra公司；uv-1700紫外分光光度计，日本岛津公司；gis凝胶图像分析系统，上海天能科技有限公司产品；nibp鼠尾无创血压测量分析系统，上海奥尔科生物科技有限公司产品；spectra max 190 酶标仪，美国molecular devices公司产品；d-78532高速冷冻离心机，德国hettich公司产品；超低温冰箱，美国thermo公司产品。
1.3 动物分组及给药将36只shr随机分为麝香保心丸（hmp）组和shr模型（shr）组，每组18只，以同周龄的wky大鼠为正常对照（wky）组，每天上午8：00～9：00 hmp组每只大鼠给予麝香保心丸13.5 mg/kg溶于1 ml蒸馏水中灌胃；wky组与shr组给予相同体积的蒸馏水。分别在给药6周、给药14周和停药9周后分3批处理动物。
1.4 检测指标
1.4.1 血压测定采用尾套法，将大鼠于38℃预热箱中预热10 min，测量大鼠在安静、清醒状态下的尾动脉压3次，取其平均值。
1.4.2 动物处理及心脏组织总rna、蛋白提取采用大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，颈椎脱臼处死，取出心脏组织液氮速冻后-80℃保存，用于总rna、蛋白样品制备。取大鼠冻存心脏组织50～100 mg，加1 ml trizol试剂，按照试剂使用说明提取总rna，所用rna的a260/a280均在1.8～2.0之间。取大鼠心脏组织约200 mg，在2 ml中含有蛋白酶抑制剂的pbs（ph7.4）中匀浆组织，4℃离心15 min两次，取上清即为总蛋白样本。
1.4.3 逆转录聚合酶链式反应（rt-pcr）按照rt试剂盒说明书进行cdna的合成，pcr扩增所需引物序列及反应条件如表1所示，β-actin作为内参照。扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳，以上海天能图像分析系统对所得条带光密度进行扫描分析。表1 pcr反应所需引物序列及条件目的基因引物序列退火温度t/℃产物大小（略）
1.4.4 蛋白质印迹（western-blot）分析 bradford法测定组织蛋白质水平，按照50 μg蛋白样品上样；总蛋白样品加上样缓冲液，100℃煮沸5 min；聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳分离总蛋白；然后将总蛋白转移至硝酸纤维素膜；用5%的脱脂奶粉室温下封闭1h，pbs-t洗膜3次，5 min/次；然后一抗vcam-1（1∶400）, icam-1（1∶400），gapdh（1∶1 000）4℃孵育过夜；pbs-t洗膜3次，5 min/次，结合有辣根过氧化酶标记的相应二抗（1∶4 000）孵育1 h,增强发光剂（ecl）显色；以gapdh蛋白表达校正作灰度相对分析。
1.4.5 心脏组织总抗氧化能力测定采用frap法［5，6］，250μl反应体系：5 μl心脏组织蛋白样品和245 μl frap工作液在37℃反应10 min后，分别以pbs 和水溶性维生素-e（trolox）作为空白和标准对照，于593 nm处测定吸光度值。组织总抗氧化活性（frap值）以达到同样吸光度所需的trolox的毫摩尔数表示，结果以μm trolox/μg protein表示。
1.4.6 elisa 测定将蛋白样品稀释100倍后，按il-1β elisa 试剂盒与tnfα elisa 试剂盒说明书操作，分别检测心脏组织炎性因子il-1β与 tnfα蛋白表达水平。结果以ng/mg protein表示。
1.5 统计学方法各组结果以 ±s表示,组间差异用单因素方差分析和q检验。p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 hmp对shr血压值的影响 由表 2可见，模型组shr收缩压较正常对照wky大鼠明显升高(p<0.05)。给药hmp 6周，14周及停药9周后，shr的收缩压与模型组大鼠比较无明显差异(p>0.05)。表2 hmp对shr血压值的影响（略）
2.2 hmp对shr心脏icam-1和vcam-1表达的影响如图1(a)、1(b)、1(c)所示，模型组shr心脏icam-1和vcam-1的mrna表达显著高于正常wky组(p<0.05)，hmp治疗后(给药6周，给药14周)可显著降低shr心脏icam-1和vcam-1的mrna表达水平(p<0.05)；停药9周后，仍可显著降低icam-1mrna表达水平(p<0.05)，但对vcam-1mrna影响无统计学差异。如图2(a)、2(b)、2(c)所示，与wky大鼠比较，模型组shr心脏可见icam-1蛋白的高表达(p<0.05)。在各处理批次（给药6周，给药14周，停药9周）hmp均能够显著降低icam-1蛋白的表达水平(p<0.05), 但对vcam-1蛋白影响无统计学差异。
2.3 hmp对shr心脏il-1β和tnf α表达的影响如图1(a)、1(d)、1(e)所示，模型组shr心脏tnf α的mrna表达显著高于正常组(p<0.05)，hmp治疗后(给药6周，给药14周，停药9周)可显著降低shr心脏tnf α的mrna表达水平(p<0.05)；但对il-1β而言，仅在hmp给药14周后，能显著降低shr心脏的il-1βmrna表达水平(p<0.05) ，给药6周后与停药9周后对对shr心脏il-1β mrna影响均无统计学差异。如表 3所示，与wky大鼠比较，模型组shr心脏可见tnf α与il-1β 蛋白的高表达(p<0.05)。hmp给药14周后均能够显著降低il-1β 和tnf α的蛋白表达水平(p<0.05)；给药6周与停药9周对shr心脏tnf α与il-1β蛋白影响均无统计学差异。表3 hmp对shr心脏炎性因子tnf α及il-1β蛋白表达的影响（略）
2.4 hmp对shr心脏总抗氧化能力的影响由表4可见，12，20，29周龄shr心脏组织总抗氧化水平均明显低于wky（p<0.05），给予hmp 6周和14周后，均能够显著提高shr心脏组织总抗氧化水平（p<0.05），在停药9周后，心脏组织总抗氧化水平仍明显高于shr组（p<0.05）。表4 hmp对shr心脏总抗氧化能力的影响（略）
3 讨论
高血压病对靶器官心脏的主要损害是心肌肥大，心肌间质纤维化以及大小冠脉血管结构和功能的改变。长期的压力负荷会导致心肌细胞肥大、间质胶原增多。心肌胶原基质的聚集和纤维化使心脏的顺应性和舒张功能降低。上述变化的发生是由心脏机械因素或体液因素所激活，并有多种生长因子及血管活性物质所介导，如血管紧张素ⅱ（angⅱ）、醛固酮等。angⅱ通过其ⅰ型受体（atⅰr）介导胶原生成，使蛋白质合成增加，心肌细胞发生肥大。另一方面，缓激肽、前列腺素、no能够使胶原降解。胶原合成与降解比例失调最终导致心肌肥厚的发生。本实验结果显示shr 7周龄时动脉收缩压明显高于同龄wky，且血压随年龄增加而升高，29周龄时血压已显著高于同龄wky，提示7周龄shr可能已产生心肌损伤。
hmp有抗心肌缺血、保护心肌作用，但其作用机制仍未阐明。本实验以shr为高血压心脏损害动物模型，结果发现给予hmp 6 周和14周后，能显著抑制shr心脏炎性相关因子icam-1、vcam-1 mrna表达及icam-1蛋白 表达；给药14周后，能显著抑制炎性相关因子il-1β、tnf α mrna表达及蛋白 表达；停药9周后，仍能抑制炎性相关因子icam-1、tnf α mrna表达及icam-1蛋白表达。众多证据显示［7～10］,炎症反应可能参与了高血压心脏损害。使用免疫抑制剂csa影响nf-κb依赖信号通路或者使用nf-κ b的抑制剂治疗dtgr大鼠，均能减轻炎症细胞浸润和心肌肥厚。icam-1、vcam-1可介导白细胞与内皮细胞粘附，白细胞粘附于内皮细胞和组织浸润，导致组织损伤，是炎症反应重要的标记物［7］。
yokoyama报道［8］心肌细胞与激活的单核细胞体外培养，心肌细胞蛋白合成增加，在加入抗icam-1单克隆抗体后，心肌细胞蛋白合成受到显著抑制。il-1β可使β-肾上腺素受体与腺苷酸环化酶脱耦联，心肌收缩力降低。研究报道［9］压力负荷刺激巨噬细胞趋化因子表达增加，引起巨噬细胞大量聚集，巨噬细胞产生许多细胞因子，以il-1β分泌尤为显著，其能促进心肌细胞的生长和左室重构。连续给大鼠腹腔注射tnfα会使左室功能时间依赖性降低并伴随左室肥厚，机制可能是使心肌细胞外基质金属蛋白水解酶活性增加,导致基质降解,同时刺激成纤维细胞增殖,参与心室重构［10］。sun［2］对shr高血压靶器官心脏组织炎症状态考察后，发现shr心脏组织炎症相关因子icam-1,tnfα, il-1β，pparγ显著高于wky，提示shr心脏存在着明显的炎症状态。由此可见炎性相关因子icam-1, vcam-1，tnfα, il-1β在高血压心脏损害中起着重要作用。
本实验研究发现hmp对shr的血压无明显影响，说明hmp可能是通过抑制心脏组织炎症反应对shr心脏起保护作用，且这种作用是独立于降压作用的。已有研究显示［11］shr心脏重量与体重之比在高血压前期（如3～4周龄）以较wky明显增加，心脏后乳头肌心肌细胞增大。甚至有研究发现，shr左室重量与体重之比早在刚出生时即较同龄wky明显增加。说明shr心脏肥大可能并不完全与高血压病有关。
炎症损伤多伴随大量ros的产生，如o-2·、ho和h2o2，导致氧化应激的产生。ros可直接修饰蛋白质、脂质、糖类和dna，引起组织损伤。ros还可通过激活对氧化还原敏感的核转录因子nf-κb，上调粘附分子、细胞因子、趋化因子等促炎因子的表达，如icam-1、il-1β、tnfα等，引起血管炎症。过量产生的o-2·可消耗no生成氧化能力更强的过硝基阴离子（onoo-），使no的生物利用度降低，损伤血管的舒张功能［12,13］。此外，o-2·水平的增加，能通过下调可溶性鸟苷酸环化酶（sgc) 表达、抑制sgc活性和cgmp依赖性蛋白激酶cgk-1活性而影响平滑肌层的no/cgmp信号途径从而影响血管功能［14］。本实验研究发现12，20，29周龄shr心脏组织总抗氧化水平均明显低于wky，提示shr心脏组织存在着明显的氧化应激状态。给予hmp 6周和14周后，均能够显著提高shr心脏组织总抗氧化水平，在停药9周后，心脏组织总抗氧化水平仍明显高于shr组，说明hmp能降低shr心脏组织的氧化应激。
总之，本研究证明shr心脏确实存在氧化应激和炎症状态。hmp具有独立降压以外的对shr心脏保护作用，其机制可能与抑制心脏组织炎症反应及降低组织氧化应激有关。关于hmp降低氧化应激的来源以及对shr心脏形态学的影响尚需今后进一步的研究。
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