作者：张艳琼， 黄利鸣， 吴江锋
【摘要】 目的通过建立荷u14小鼠宫颈癌模型，从个体水平初步探索天花粉蛋白（tcs）对荷瘤小鼠体内抗肿瘤活性。方法建立荷u14小鼠宫颈癌模型，tcs治疗，检测抑瘤率、脾指数、流式细胞术分析t细胞亚群。结果tcs治疗组，脾指数明显高于阴性对照组，c较阴性对照组、ctx组明显减少（p<0.05）；与正常组比较无显著性差异。tcs组的c/c较阴性对照组、正常组明显增大（p<0.05）；与ctx组比较无显著性差异。结论在体内，当tcs的剂量为0.2 mg/kg时，具有一定的免疫调节和增强体液免疫功能作用。
【关键词】 天花粉蛋白 荷瘤鼠 抑瘤作用
abstract：objective to study the anti-tumor effect of trichosanthin(tcs) in u14 mice.methodsafter setting up the animal model of u14, the subset of the t cells was analyzed by the tumor inhibitory rate, the index of spleen and fcm. resultsafter treatment with tcs, the index of spleen was increased obviously compared with the negative group, the c decreased obviously compared with the negative and ctx groups（p<0.05）, but had no significant difference as compared with the normal group. the c/c in tcs group was increased obviously compared with the negative and normal groups（p<0.05）, but had no siguificant difference as compared with the ctx group.conclusionthe tcs can regulate immunity and increase the humoral immunity in vivo when its dose is 0.2 mg/kg.
key words：trichosanthin; mice with tumor; effect of tumor- inhibition
人子宫颈癌是导致妇女死亡的一种常见恶性肿瘤。wWW.11665.cOM天花粉蛋白（trichosanthin，tcs)是从葫芦科植物栝楼trichosanthin kirilouii maxim的块根中提取的一种单链核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，rip)。体外大量实验证实其具有抗宫颈癌的作用［1，2］，为进一步证实tcs是否具有体内抗宫颈癌和调节机体免疫的活性，我们进行了tcs对荷小鼠宫颈磷癌u14裸鼠体内实验研究。
1 材料
1.1 材料tcs购自上海金山制药厂（1.2mg/ml）；环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司； rpmi-1640培养基购自gibcol公司；pe标记c抗体购自ebioscience公司；fitc标记c抗体购自ebioscience 公司；倒置显微镜和多功能显微镜及图像分析系统购自德国leica公司；epicsxl-4型流式细胞仪购自beckman coulter公司。u14肿瘤细胞株由三峡大学医学院免疫重点实验室提供。
1.2 动物6～8周龄近交系balb/c小鼠32只，体质量18～20 g，雌性，购自武汉大学实验动物中心。
2 方法
2.1 tcs对实体瘤的抑制作用复苏u14细胞株，昆明小鼠腹腔中反复传代，第3代后5～7 d，取小鼠腹水，用无菌生理盐水调整细胞浓度为2×107/ml。常规消毒后，取0.2 ml细胞悬液接种于balb/c小鼠右侧腋窝皮下。接种后的小鼠随机分3组：tcs实验组、阴性和阳性对照组，每组8只。tcs实验组：用生理盐水稀释tcs注射液，药物浓度为0.2 mg/kg，0.2 ml/只，给药1次/d，连续给药10次。阳性对照组：环磷酰胺（cytoxan, ctx），30 mg/kg。阴性对照组给予等体积的生理盐水。另设正常组8只，不进行任何处理。
2.2 组织取材和称重第11天称小鼠体质量。眼球取血，置于加有抗凝剂的试管内。处死小鼠，取出肿瘤组织、脾脏，称瘤重、脾重，计算抑瘤率(inhibition rate, ir)。计算脾指数，公式为：脾指数(si)=脾脏重量(s)/体质量(w)(g/g)。
2.3 流式细胞术分析t细胞亚群将血液中分别加入pe标记的c、fitc标记的c单克隆抗体各20 μl，混匀，于室温下避光作用15～30 min。每个试管内加入溶血剂2 ml，颠倒混匀后放暗处10 min，离心，用pbs洗1次，加1%甲醛pbs液0.6 ml，固定10～30 min，经流式细胞仪检测每管中c，c细胞百分比。
2.4 统计学处理实验数据以±s表示，采用spss10.0软件进行分析（t检验）。
3 结果
3.1 小鼠一般情况的观察小鼠皮下接种u14瘤细胞5 d内外观无明显的变化，活泼，大小便、饮食正常；接种癌细胞5～7 d后可触及皮下肿块，成瘤率100%，生理盐水组后期肿瘤生长迅速。
3.2 tcs对荷瘤小鼠体质量、脾重和瘤重的影响结果见表1。表1 荷瘤小鼠的体质量、脾指数、瘤重和抑瘤率（略）
3.3 流式细胞仪检测t细胞亚群的结果实验结果表明：①阳性对照组的c较其它各组均明显增高，差异有显著性（p<0.05）；阴性对照组的c较其它组均明显减少，与tcs组有差别（p<0.05），与正常对照组比较统计学上无差异；②tcs组的c较阴性对照组、阳性对照组明显减少（p<0.05）；与正常组比较无显著性差异；③tcs组的c/ c较阴性对照组、正常组明显增大（p<0.05）；与阳性对照组比较无显著性差异；其它各组之间无显著性差异。结果见表2。表2 天花粉蛋白对荷瘤小鼠t细胞的影响（略）
4 讨论
tcs具有广泛地抗肿瘤作用，现陆续有报道tcs具有体内抗实验性肿瘤作用。孙健等［3］在研究tcs抑制肝癌肺转移时，应用lci-d20模型观察荷瘤裸鼠肺转移发现tcs组肺转移率为41.7%(5/12)，而对照组高达100%(20/20)。为了进一步提高tcs的疗效，靶向治疗受到重视，将重组免疫毒素 egf-tcs 重组蛋白用于荷人肝癌 bel-7402裸鼠体内的实验研究，可以有效地抑制实体瘤的生长［4］。众多体外实验也证实，tcs能引起多种宫颈癌细胞株凋亡［1，2］。而对其是否具有体内抑制宫颈癌生长的作用，尚未见报道。为了证实其疗效，我们通过建立荷u14小鼠动物模型，检测了tcs的体内抗宫颈癌效果。小鼠子宫颈鳞癌u14是应用专用线结经甲基胆蒽浸泡后, 穿进幼鼠宫颈诱发成瘤后，移植于远交系km小鼠皮下形成的一个异位子宫颈癌, 能在小鼠皮下形成实体瘤(成瘤率达100%)，因此建立 u14动物模型是研究宫颈癌的理想模型［5］。我们的研究表明tcs的抑瘤率是11.2%，采用重组免疫毒素egf-tcs进行靶向治疗是否可以进一步提高抑瘤率值得进一步探讨。
tcs通过不同途径影响机体的细胞免疫和体液免疫。tcs可使正常人外周血c和cd+20t细胞百分比升高, ct细胞百分比下降, 从而使c/c比值增大［6］。tcs能诱导th2细胞中il-4和il-10的表达，但抑制th1细胞中il-2和ifn-gamma的表达［7］。我们初步探索了剂量为0.2 mg/kg的tcs在机体免疫应答中的作用，tcs可以引起小鼠外周血中c细胞显著增加, c明显减少，c/ c比值升高，该结果与tcs对人体外周血的影响吻合［6］，因此，tcs具有一定的免疫调节和增强体液免疫功能的作用。
【参考文献】
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［5］李秀真, 朱万孚, 曹卉，等.乳酸杆菌诱导小鼠宫颈鳞癌u14细胞凋亡的动物实验［j］.中华微生物学和免疫学杂志，2004，24（4）：268.
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