作者：张艳琼，黄利鸣，李红军，吴江锋
【摘要】 目的探讨天花粉蛋白(tcs)对人宫颈癌caski细胞生长的抑制作用及量-效关系。方法不同浓度tcs作用于体外培养人宫颈癌caski细胞株，采用吖啶橙荧光染色，荧光显微镜观察tcs对caski细胞的生长抑制作用；透射电镜和tunel检测法观察caski细胞凋亡及tcs诱导caski细胞凋亡的量效关系。结果tcs对caski细胞的生长具有明显的抑制作用，透射电镜和tunel法证实该抑制作用是通过诱导细胞凋亡实现的。在一定浓度范围内，细胞凋亡数与tcs的浓度之间有剂量依赖性。结论tcs能诱导体外培养caski细胞凋亡，最佳浓度为60 μg/ml。
【关键词】 天花粉蛋白； caski细胞； 细胞凋亡
abstract:objectiveto study the inhibitory effect of different dose trichosanthin (tcs) on caski cells. methodsthe antiproliferative effect of different dose tcs on caski cells was observed by fluorescence microscope. the tunel assay and electromicroscope were used for measurement of apoptosis of different dose tcs on the caski. results the apoptosis of different dose tcs on caski cells acted as the antiproliferation. the quantity of the apoptosis of the caski cells depended on tcs' dose within certain range. conclusionthe apoptosis of the caski cells will happen when they were dealt with tcs and the best dose of the tcs is 60 μg/ml.
key words:trichosanthin; caski cell; apoptosis
人子宫颈癌是常见妇科恶性肿瘤，严重威胁妇女健康。Www.11665.Com天花粉蛋白(trichosanthin，tcs)是从葫芦科植物栝楼trichosanthin kirilouii maxim的块根中提取的一种单链核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，rip)，迄今的研究发现tcs具有抗绒毛膜上皮癌、胃肠道肿瘤、白血病和子宫颈腺癌等恶性肿瘤作用［1,2］。本实验旨在研究tcs对人子宫颈磷癌细胞的作用，并探讨其量-效关系，为tcs在抗宫颈癌的临床应用提供实验依据。
1 材料与仪器
tcs购自上海金山制药厂（1.2 mg/ml）；rpmi-1640培养基购自gibcol公司；10%新生牛血清购自杭州四季青公司；吖啶橙购自sigma公司；dnasei购自上海博亚生物技术有限公司；triton x-100购自华美生物工程公司；dab试剂盒购自北京中山生物技术有限公司；tunel试剂盒购自roche公司；倒置显微镜和多功能显微镜及图像分析系统购自德国leica；h-7500型透射电镜购自日立。
2 方法
2.1 细胞培养人子宫颈鳞癌caski细胞株(中国协和医科大学基础研究所生物物理教研室馈赠)，培养于5%co2，37℃湿化孵箱中。培养基rpmi-1640中含10%新生牛血清，0.1 u/l青霉素，0.1 u/l链霉素，所有实验均取对数生长期细胞。
2.2 倒置和荧光显微镜观察细胞的形态学变化体外培养的caski细胞用pbs处理为阴性对照组、实验组分别用不同浓度（20,40，60，80，100 μg /ml）tcs处理24 h和48 h后，加入0.01%吖啶橙磷酸缓冲液（ph 6.0）50 μl，轻轻混匀，静置2 min后，于荧光显微镜下观察并记录图像。
2.3 透射电子显微镜观察实验组以60 μg /ml的tcs处理caski细胞24 h和48 h，pbs处理为阴性对照组。2.5%戊二醛固定、包埋、超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸钠硝酸铅双重染色后，倒置电镜下观察并拍照。
2.4 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（tunel）检测实验组用不同浓度（20,40,60,80,100 μg /ml）tcs处理caski细胞24 h。按tunel试剂盒说明操作。用dnaseⅰ处理caski为阳性对照，试剂2替代tunel反应混合溶液为阴性对照。凋亡细胞的判断：胞核棕黄色染色为阳性，阴性细胞不显色。
2.5 图像分析软件定量分析每一玻片任选10个视野，计算在200倍光镜下检测凋亡阳性细胞的个数、平均面积和平均灰度［3］。数据统计学分析用spss 10. 0统计软件（t检验）。
3 结果
3.1 倒置显微镜下观察对照组细胞呈梭形，贴壁牢固、密集，折光性好，胞质饱满；实验组中经20 μg/ml tcs作用48 h后细胞间隔增大, 细胞体积缩小，胞浆凝缩，折光率增强，贴壁性差；60 μg/ml tcs浓度作用48 h脱落细胞数增加, 细胞表面出现发泡现象；tcs药物浓度达到100 μg/ml作用24 h后即出现上述特征。
3.2 荧光显微镜下观察经吖啶橙荧光染色后，长链的dna在荧光显微镜592 nm波长紫外线激发下发出绿色荧光，而rna发出黄色或黄绿色荧光。本实验的阴性对照组的细胞核dna为绿色均匀荧光（图1）；各实验组均可见到凋亡的细胞：细胞膜完整，细胞核或细胞质可见致密浓染的黄色荧光，出现凋亡小体（图2）。
3.3 透射电镜观察阴性对照组细胞表面微绒毛丰富，胞质内可见线粒体、粗面内质网、游离核糖体，核仁明显，未发现凋亡细胞（图3）。tcs处理细胞可见明显的细胞凋亡：细胞膜完整，染色质局部增多且趋边凝聚，核固缩，有凋亡小体形成；部分细胞表面微绒毛减少或消失，胞质可见大量空泡结构；细胞核趋边，呈半月形；有的细胞核碎裂为一个或多个致密小体（图4）。
3.4 tunel法检测结果tcs处理细胞后24 h，采用tunel法染色细胞核呈棕黄色的细胞判为凋亡细胞，未被染色为非凋亡细胞。阴性对照组未见凋亡细胞，而阳性对照组和各实验组均可见大量的胞核棕黄色染色细胞，采用图像分析软件定量分析阳性细胞（表1）。表1 tcs作用caski细胞后图像定量分析结果（略）
表1中凋亡细胞数量显示，在一定浓度范围内（20 μg/ml到60 μg/ml），随着tcs浓度逐渐增加，凋亡细胞的数量也随之增多；tcs的剂量从60 μg/ml增高到100 μg/ml，凋亡数减少；剂量为60 μg/ml时，凋亡数最多。
由表1中的单个细胞平均面积数可以看出，除60 μg/ml 的tcs剂量组略大于阳性对照组外，其它各剂量组的平均面积均显著大于阳性对照组（p<0.05）。
由表1中的平均灰度可以看出，阴性对照组、60，80 μg/ml各剂量组的单个细胞的平均灰度均显著高于20，40，100 μg/ml剂量组（p<0.05）。
4 讨论
子宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，约80%～95%为鳞状细胞癌，其次为腺癌或其它类型癌。自从ru qh［2］发现tcs能引起人子宫颈腺癌细胞系hela细胞凋亡以来，有学者［4～6］对tcs引起hela细胞的凋亡机制进行了较为深入的探讨。发现tcs处理可以引起 hela细胞中多个基因的表达改变，其中bcl-2蛋白表达减少、bax蛋白增多和creb蛋白的磷酸化；实验还显示tcs引起hela细胞凋亡与抑癌基因的去甲基化有关。但文献对发病率较高的子宫颈鳞状细胞癌的报告很少［7］，目前认为，tcs能抑制体外子宫颈鳞状细胞癌caski细胞的生长，该过程可能与对opcml、dapk基因的去甲基化作用有关。本实验研究了tcs在体外对人子宫颈鳞癌caski细胞的生长影响，通过吖啶橙荧光染色、tunel法和透射电镜等多种方法检测了细胞凋亡。结果显示，多种浓度的tcs均能诱导子宫颈鳞癌caski细胞凋亡。
在研究tcs作用于hela细胞量效关系时发现，hela细胞的凋亡比例与tcs具有剂量依赖性［8］。为了进一步开发tcs抗宫颈癌的潜在价值，为临床治疗提供更细致的客观数据，本研究进一步研究了tcs作用于子宫颈鳞癌caski细胞的量-效关系。结果表明，tcs的剂量从20 μg/ml到60 μg/ml，随着浓度的增高，细胞凋亡数明显增加，表明药物在一定的浓度范围内，两者有一定的剂量依赖关系；剂量从60 μg/ml增高到100 μg/ml，对凋亡的影响越来越小；剂量为60 μg/ml时，凋亡最明显。该实验将为tcs在抗宫颈癌的临床应用提供一定的实验依据。
【参考文献】
［1］孙 景，涂水平，吴裕圻，等.天花粉蛋白诱导胃癌细胞mkn245凋亡中p53、bcl-2、c-myc蛋白表达变化［j］.上海医学，2001,21(4):291.
［2］ru qh, luo ga, liao jj,et al. capillary electrophoretic determination of apoptosis of hela cells induced by trichosanthin［j］.j chromatogr a, 2000,894(1-2):165.
［3］常青，唐海兰.pacap对vsmc表达增生细胞核抗原影响的定量分析［j］.中国病理生理学杂志，1998,14:617.
［4］黄益玲，胡火军，黄利鸣，等.天花粉蛋白诱导人宫颈癌 hela细胞凋亡的分子机制研究［j］.中国药理学通报，2007,23 (1) : 99.
［5］wang p, li jc.trichosanthin-induced specific changes of cytoskeleton configuration were associated with the decreased expression level of actin and tubulin genes in apoptotic hela cells［j］.life sci，2007,81(14):1130.
［6］wang p, yan h, li jc. creb-mediated bcl-2 expression in trichosanthin-induced hela cell apoptosis［j］.biochem biophys res commun， 2007 ,363(1):101.
［7］王艳华，黄利鸣.opcml、dapk基因甲基化与宫颈癌caski细胞凋亡相关性的研究［j］.中国药理学通报，2008，24 (4) : 543.
［8］dou cm, li jc. effect of extracts of trichosanthes root tubers on hepa-h cells and hela cells［j］.world j gastroenterol. 2004 ,10(14):2091.
3 结果
3.1 倒置显微镜下观察对照组细胞呈梭形，贴壁牢固、密集，折光性好，胞质饱满；实验组中经20 μg/ml tcs作用48 h后细胞间隔增大, 细胞体积缩小，胞浆凝缩，折光率增强，贴壁性差；60 μg/ml tcs浓度作用48 h脱落细胞数增加, 细胞表面出现发泡现象；tcs药物浓度达到100 μg/ml作用24 h后即出现上述特征。
3.2 荧光显微镜下观察经吖啶橙荧光染色后，长链的dna在荧光显微镜592 nm波长紫外线激发下发出绿色荧光，而rna发出黄色或黄绿色荧光。本实验的阴性对照组的细胞核dna为绿色均匀荧光（图1）；各实验组均可见到凋亡的细胞：细胞膜完整，细胞核或细胞质可见致密浓染的黄色荧光，出现凋亡小体（图2）。
3.3 透射电镜观察阴性对照组细胞表面微绒毛丰富，胞质内可见线粒体、粗面内质网、游离核糖体，核仁明显，未发现凋亡细胞（图3）。tcs处理细胞可见明显的细胞凋亡：细胞膜完整，染色质局部增多且趋边凝聚，核固缩，有凋亡小体形成；部分细胞表面微绒毛减少或消失，胞质可见大量空泡结构；细胞核趋边，呈半月形；有的细胞核碎裂为一个或多个致密小体（图4）。
3.4 tunel法检测结果tcs处理细胞后24 h，采用tunel法染色细胞核呈棕黄色的细胞判为凋亡细胞，未被染色为非凋亡细胞。阴性对照组未见凋亡细胞，而阳性对照组和各实验组均可见大量的胞核棕黄色染色细胞，采用图像分析软件定量分析阳性细胞（表1）。表1 tcs作用caski细胞后图像定量分析结果（略）
表1中凋亡细胞数量显示，在一定浓度范围内（20 μg/ml到60 μg/ml），随着tcs浓度逐渐增加，凋亡细胞的数量也随之增多；tcs的剂量从60 μg/ml增高到100 μg/ml，凋亡数减少；剂量为60 μg/ml时，凋亡数最多。
由表1中的单个细胞平均面积数可以看出，除60 μg/ml 的tcs剂量组略大于阳性对照组外，其它各剂量组的平均面积均显著大于阳性对照组（p<0.05）。
由表1中的平均灰度可以看出，阴性对照组、60，80 μg/ml各剂量组的单个细胞的平均灰度均显著高于20，40，100 μg/ml剂量组（p<0.05）。
4 讨论
子宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，约80%～95%为鳞状细胞癌，其次为腺癌或其它类型癌。自从ru qh［2］发现tcs能引起人子宫颈腺癌细胞系hela细胞凋亡以来，有学者［4～6］对tcs引起hela细胞的凋亡机制进行了较为深入的探讨。发现tcs处理可以引起 hela细胞中多个基因的表达改变，其中bcl-2蛋白表达减少、bax蛋白增多和creb蛋白的磷酸化；实验还显示tcs引起hela细胞凋亡与抑癌基因的去甲基化有关。但文献对发病率较高的子宫颈鳞状细胞癌的报告很少［7］，目前认为，tcs能抑制体外子宫颈鳞状细胞癌caski细胞的生长，该过程可能与对opcml、dapk基因的去甲基化作用有关。本实验研究了tcs在体外对人子宫颈鳞癌caski细胞的生长影响，通过吖啶橙荧光染色、tunel法和透射电镜等多种方法检测了细胞凋亡。结果显示，多种浓度的tcs均能诱导子宫颈鳞癌caski细胞凋亡。
在研究tcs作用于hela细胞量效关系时发现，hela细胞的凋亡比例与tcs具有剂量依赖性［8］。为了进一步开发tcs抗宫颈癌的潜在价值，为临床治疗提供更细致的客观数据，本研究进一步研究了tcs作用于子宫颈鳞癌caski细胞的量-效关系。结果表明，tcs的剂量从20 μg/ml到60 μg/ml，随着浓度的增高，细胞凋亡数明显增加，表明药物在一定的浓度范围内，两者有一定的剂量依赖关系；剂量从60 μg/ml增高到100 μg/ml，对凋亡的影响越来越小；剂量为60 μg/ml时，凋亡最明显。该实验将为tcs在抗宫颈癌的临床应用提供一定的实验依据。
【参考文献】
［1］孙 景，涂水平，吴裕圻，等.天花粉蛋白诱导胃癌细胞mkn245凋亡中p53、bcl-2、c-myc蛋白表达变化［j］.上海医学，2001,21(4):291.
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［3］常青，唐海兰.pacap对vsmc表达增生细胞核抗原影响的定量分析［j］.中国病理生理学杂志，1998,14:617.
［4］黄益玲，胡火军，黄利鸣，等.天花粉蛋白诱导人宫颈癌 hela细胞凋亡的分子机制研究［j］.中国药理学通报，2007,23 (1) : 99.
［5］wang p, li jc.trichosanthin-induced specific changes of cytoskeleton configuration were associated with the decreased expression level of actin and tubulin genes in apoptotic hela cells［j］.life sci，2007,81(14):1130.
［6］wang p, yan h, li jc. creb-mediated bcl-2 expression in trichosanthin-induced hela cell apoptosis［j］.biochem biophys res commun， 2007 ,363(1):101.
［7］王艳华，黄利鸣.opcml、dapk基因甲基化与宫颈癌caski细胞凋亡相关性的研究［j］.中国药理学通报，2008，24 (4) : 543.
［8］dou cm, li jc. effect of extracts of trichosanthes root tubers on hepa-h cells and hela cells［j］.world j gastroenterol. 2004 ,10(14):2091.
