【摘要】 目的观察小柴胡汤对hl-60白血病细胞的体外分化诱导作用，并初步探讨其作用机制。方法通过药物作用后观察细胞形态学的变化，细胞吞噬功能及硝基蓝四氮唑（nbt）还原能力的改变；流式测定细胞周期改变和免疫组化检测抑癌基因p53的表达变化初步揭示其作用机制。结果小柴胡汤能使hl-60细胞显著向成熟粒系细胞分化而且吞噬功能、nbt还原能力出现增强的趋势，以中、高剂量组最为显著(p<0.05)；并使 hl-60的细胞周期阻滞于g0/g1期,s期细胞数减少，抑癌基因p53表达明显升高(p<0.05)。结论小柴胡汤可诱导hl-60细胞向粒系成熟分化；其作用机制可能与阻滞细胞于g0/g1期，并且上调抑癌基因p53的表达有关。
【关键词】 小柴胡汤 hl-60 分化诱导
abstract：objectiveto observe the effects of hl-60 cell differentiation induced by xiaocaihu decoction and to discuss its mechanism.methodsthe cells differentiation was observed on some changes of cytomorphology, the cell swallow function and nbt reducing ability. according to the changes of cell cycle by flow cytometry and anti-oncogene p53 expression by immunity histochemistry, the mechanism was revealed preliminarily.resultscompared with the blank control group ,the cell differentiation was induced into mature granulocyte morphologically and hl-60 cell phagocytosis and nbt reduction ability were enhanced markedly in middle-dose and high-dose xiaochaihu decoction groups(p<0.05). compared with the blank control group, hl－60 cell cycle was blocked into g0/g1 phase and the cell amount in s phase was decreased in middle-dose and high-dose xiaochaihu decoction groups and p53 expression was enhanced significantly (p<0.05) in high-does xiaocaihu decoction group.conclusionhl－60 cells can be induced differentiation into mature granulocyte by xiaocaihu decoction and the mechanism may be related with blocking cells into g0/g1 phase and increasing p53 expression.
key words：xaochaihu decoction； hl-60； differentiation induction
长期以来“一旦成为癌细胞永远就是癌细胞”的概念一直统治着肿瘤学领域，但随着科技的不断深入，目前肿瘤逆转研究已成为肿瘤生物学的一个热门课题，对传统中医中的代表方剂小柴胡汤现代研究发现其具有广泛和多方面的抗癌作用［1～4］。wWw.11665.COm
为了科学全面揭示此方的抗癌机理以及开发出新的诱导分化剂，我们选择对小柴胡汤诱导hl-60肿瘤细胞分化及其作用机制进行初步探索，以不断完善这首著名方剂抗癌作用的研究和挖掘它诱导肿瘤细胞分化的潜力。
1 材料与仪器
1.1 细胞株人早幼粒白血病hl-60细胞株由中国医学科学院药物研究所赠送。
1.2 药品小柴胡汤水煎液，配方：柴胡12 g，黄芩4.5 g，半夏3.75 g，生姜4.5 g，人参4.5 g，大枣4 g，炙甘草4.5 g，均购于北京同仁堂成都分店；剂量按原方比例确定；药液煎煮、离心取上清液，经40～60℃低温浓缩成1g/ml药液；用消毒三蒸水分别配制成浓度为0.01，0.05，0.2 mg/ml的稀释液；过滤消毒，-20℃保存。全反式维甲酸 (sigma公司产品，批号：20050510)：atra先配制成浓度为10-1mol/ml的储存液,使用前用无血清rpmi1640培养液配制至终浓度为10-6mol/ml的稀释液；rpmi1640培养基（gibco公司产品，批号：1402027）；硝基四唑氮蓝(sigma公司产品，批号：1202775)；佛波酯（sigma公司产品，批号：290452）；聚苯乙烯颗粒（sigma公司产品，批号：1705027）。
1.3 试剂鼠抗人p53单抗（晶美生物工程有限公司，批号：0603138）；即用型sabc（过氧化物酶）免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，sa1022）；dab显色剂（北京中山生物技术有限公司，zli-9032，lot：20168834）。
2 方法
2.1 细胞培养与分组将hl－60细胞置37℃,5% co2孵箱中体外培养，取对数生长期的细胞进行实验。实验分为低剂量（0.01mg/ml）小柴胡汤组、中剂量（0.05 mg/ml）小柴胡汤组、高剂量（0.2 mg/ml）小柴胡汤组、全反式维甲酸(atra)组、空白对照组5组。
2.2 细胞分化状况检测
2.2.1 细胞形态学观察以0.5×105个细胞/孔接种于24孔板中，分组加药，空白对照组加同等体积的无血清rpmi1640培养基。细胞培养6 d后，收集细胞悬液；pbs液洗涤，离心，去上清液；沉淀加甲醇固定10min左右，涂片，常规wright－giemsa染色；油镜下观察计200个细胞，按其分化成熟度分类。
2.2.2 吞噬功能测定（聚苯乙烯颗粒法）细胞接种浓度，药物处理细胞方法同上。细胞培养6 d后，收集细胞悬液；pbs液洗涤、离心、去上清液；沉淀加入反应液（聚苯乙烯乳胶颗粒溶液/无血清rpmi1640培养基，按2 μl/ml混合），每管加1 ml，混匀后置37℃、5%co2孵箱中保温4h；收集细胞，离心，用pbs洗3次；吸取少许细胞悬液到载玻片上，并滴加一小滴0.5%的伊红，快速用盖玻片盖上在油镜下观察200个细胞，细胞内有5个以上颗粒的为阳性细胞，计算各组阳性细胞百分率。
2.2.3 硝基蓝四氮唑（nbt）还原能力测定细胞接种浓度，药物处理细胞方法同上。细胞培养6 d后，收集细胞悬液，pbs液洗涤、离心、去上清液；沉淀加入0.1％nbt 0.5 ml和200 μg/ml的tpa 20 μl，混匀；37℃ 3 h，离心终止反应；沉淀加甲醇固定10 min左右，涂片，常规wright－giemsa染色；油镜下观察200个细胞，胞质内有蓝紫色颗粒者为nbt阳性细胞，计算各组阳性细胞百分率。
2.2.4 流式细胞仪分析细胞周期以1×105个细胞/孔接种于6孔板中，药物处理细胞方法同上。细胞培养6d后，收集细胞悬液，pbs液洗涤3次，离心，去上清液；沉淀加1 ml 70%冷乙醇固定并重悬(细胞数>106个)，用流式细胞仪分析。
2.2.5 免疫组化检测p53的表达以0.5×105个细胞/孔接种于24孔板中，药物处理细胞方法同上。细胞培养6 d后，收集细胞悬液，pbs洗涤，离心，弃上清液；沉淀加入10%甲醛固定10 min，涂片，常规免疫组化abc法染色；油镜下观察200个细胞，胞浆内有棕褐色颗粒者为阳性细胞，计算各组阳性细胞百分率。
2.2.6 统计学处理除细胞周期检测重复2次外，其余实验均重复3次。结果采用spss12.0统计软件处理，组间计量资料采用单因素方差分析，计数资料采用卡方检验。
3 结果
3.1 细胞形态学观察
经中、高剂量小柴胡汤作用后，部分细胞形态发生明显改变，主要向成熟粒系细胞分化，表现为核呈圆形、椭圆形，有时偏向一侧，或核呈肾形，染色质变致密，核仁减少或消失，核浆比例缩小。按细胞分化成熟程度分类，油镜下每组观察200个细胞得出：与空白对照组比较，中、高剂量小柴胡汤组的中幼粒、晚幼粒细胞增多，以中幼粒细胞增多为主，分叶核、杆状核细胞无明显变化，早幼粒细胞减少；与atra组比较，它们的中幼粒、晚幼粒细胞、分叶核、杆状核细胞比例均低于atra。结果见表1。表1 不同剂量小柴胡汤对hl-60细胞形态的影响（略）
3.2 吞噬功能及硝基蓝四氮唑（nbt）还原能力测定结果见表2。从表2可以看出，与空白对照组比较，低剂量小柴胡汤使hl-60细胞吞噬及nbt还原能力出现增强的趋势，但无统计学意义(p>0.05)；中、高剂量小柴胡汤则使其明显增强，比较有显著性差异 (p<0.05)。然而，不同剂量小柴胡汤增强hl-60细胞吞噬功能的作用均低于atra，差异有显著性(p<0.05)。表2 不同剂量小柴胡汤对hl-60细胞吞噬及nbt还原功能的影响(略)
3.3 流式细胞仪分析细胞周期结果见表3。从表3可以看出，与空白对照组相比较，经中、高剂量小柴胡汤作用后的hl-60的细胞周期呈现阻滞于g0/g1期，s期细胞数减少的趋势。但是atra的这种作用趋势更加明显。表3 不同剂量小柴胡汤对hl-60细胞周期的影响（略）
3.4 免疫组化检测p53的表达结果见表4。从表4可以看出，与空白对照组比较，低、中剂量小柴胡汤使p53的表达无明显变化(p>0.05)；高剂量小柴胡汤则使p53的表达明显升高(p<0.05)。不同剂量小柴胡汤升高hl-60细胞p53表达的作用均低于atra，差异有显著性(p<0.05)。表4 不同剂量小柴胡汤对抑癌基因p53表达的影响(略)
4 讨论
中医学认为，正气亏虚，气滞血瘀，津凝痰聚、热毒内蕴、脏腑功能失调以及经络瘀阻等是肿瘤最基本的病机；此外，肿瘤往往具有正虚邪实、寒热错杂、升降失调等复杂的病理特点。而少阳病也存在着正气不足，气滞血瘀，津凝痰聚的病机变化，同时亦具有正虚邪侵、寒热错杂、表里同病、升降失调等的病理特点。由此可知，肿瘤与少阳病在病机变化、病理特点上有相同之处，故根据中医辨证论治的原则，二者在治疗上也具有一定的相通性。因而选用和解少阳的代表方剂小柴胡汤以达到异病同治的目的。方中柴胡、黄芩、半夏等药祛其外邪，清其郁，畅其气机，通其津液，以减少细胞的恶性表型；人参、甘草、大枣等补益元气，调和气血，促进细胞成熟。它们互相配合，扶正祛邪共用，清宣温化并行，升清降浊同施，共奏抗癌之功。
在实验过程中发现，小柴胡汤可诱导hl-60细胞向粒系成熟分化，但作用不及atra；其作用机制可能与阻滞细胞于g0/g1期，并且上调抑癌基因p53的表达有关。
【参考文献】
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