【摘要】 目的研究复合法降解壳聚糖及降解产物的生物活性方法在纤维素酶降解的后期引入h2o2氧化降解壳聚糖。观察其降解产物对糖尿病小鼠生化指标的影响。结果最佳工艺条件为：纤维素酶降解时酶糖比0.2，ph 4.6、50℃、时间为3 h，后续h2o2降解时h2o2用量为0.8～1.0(ml/g)、75℃、时间为1.5 h，所得降解产物的平均分子量约为1 700。工艺所生产的低聚壳聚糖用量为 100 mg/kg时具有明显的降血糖生物活性，其功效甚至优于拜糖苹。结论该复合降解工艺具有成本低，易于工业化，而且所得产品具有较高的生物活性。
【关键词】 壳聚糖; 低聚壳聚糖; 降解; 血糖; 生物活性
abstract：objectiveto investigate chitosan degradated by combined method and production biological activity of degradation. methodschitosan was first degradated by cellulase depolymerization, and then was oxidated by h2o2. the effects of degradation on diabetic mice was observed. resultsthe optimum cellulase depolymerization conditions were the mass of cellulase to chitosan (n)0.1, ph4.6,temperature(t)50℃ and time(t)3h. the optimum h2o2 oxidation conditions were the proportion of h2o2 to chitosan (n)0.8～1 ml/g, temperature(t)75℃, time(t) 1.5h. under the optimum degradation condition about 1700 oligochitosan could be obtained. moreover, the prepared oligochitosan showed obviously lowering blood-glucose activity when given to mice at a dose of 100 mg/kg and its effect was even over acarbose. conclusionthis combined degradation method to chitosan is not only lowly cost and easy to industrialize, but also its preduct has a higher biological activity.
key words： chitosan; oligochitosan; degradation; blood glucose; biologic activity
壳聚糖作为天然碱性多糖，其资源量仅次于纤维素，分子量从几十万到几百万不等。WWW.11665.COM降解后的低聚壳聚糖因溶解性增强，容易被吸收利用，尤其是分子量在1 500左右的产品显示出独特的生理活性和功能[1]。目前，由壳聚糖降解制备优质低聚壳聚糖的工业化生产成为该多糖广泛推广使用的瓶颈。在已有研究的众多降解方法中，非专一性酶降解和h2o2氧化降解法比较有望实现大规模化生产。其中h2o2氧化降解具有成本低、降解速度快、产品无残毒等优势。但反应在h2o2用量大、温度高及反应时间长的条件下易发生副反应，制备产品的活性也受到质疑。与其相比，酶降解由于无副反应、降解条件温和、降解过程容易控制、产品生物活性高而引起人们的广泛关注[2]。在众多非专一性酶的筛选过程中，纤维素酶因存在广泛，生产成本低，对壳聚糖具有一定降解作用而受到重视，但纤维素酶活力有限，降解效率低，产物分子量分布较宽[3]。为此，本研究在纤维素酶降解的后期向体系内引入h2o2快速氧化降解，以提高反应速率、缩小产品分子量分布宽度。最后对制备的低聚壳聚糖产品进行降血糖生物活性研究，以评价该制备工艺的可行性。
1 器材
1.1 材料壳聚糖，济南海得贝海洋生物工程有限公司，脱乙酰度>90%;纤维素酶，天津丽华制剂厂，酶活力≥40 000 u·mg-1;h2o2，30%分析纯。拜糖苹，北京拜尔医药保健有限公司产品;四氧嘧啶，sigma公司提供。
1.2 仪器20m3柔性反应釜，德国进口;小型板框压滤机，浙江省海宁市丰源过滤设备有限公司;dzf-6050型离心喷雾干燥器，常州市一步干燥设备厂;lc-10ad凝胶色谱仪，日本岛津;血糖仪，上海荣盛生物技术有限公司提供。
1.3 动物3月龄雄性昆明小鼠，体质量20 ～30 g，军事医学科学院实验动物中心提供。
2 方法
2.1 降解实验
2.1.1 纤维素酶的降解实验在搅拌的情况下，将200 g壳聚糖按1∶50(w/v)混合，加入适量冰醋酸溶解后，快速升温至所需温度，加纤维素酶进行恒温降解。达到预定时间后迅速升温至100℃使酶失活，取样稀释过滤、用凝胶色谱分析产物的平均分子量[3]。实验以酶糖比n、ph和温度t为主要影响因素设计l9(34)正交实验，得最佳组合工艺条件为n=0.1，ph=4.6，t=50℃。
2.1.2 h2o2氧化降解工艺条件的确定在纤维素酶降解的基础上升温至预定温度，加入h2o2后继续降解，到预定时间后取样、过滤分析产物平均分子量。最后在确定的最佳复合降解工艺条件下对壳聚糖进行降解，卸料降温，板框压滤、喷雾干燥后待用。
2.2 降解物对糖尿病小鼠生化指标的影响
2.2.1 高血糖模型的复制及分组小鼠禁食12 h，四氧嘧啶生理盐水溶液(2%)腹腔注射(一次性给药)，剂量为180 mg/kg，72 h后空腹尾尖取血，血糖仪测血糖，大于11 mol/l的小鼠入选糖尿病模型。取10只正常小鼠为正常组。将造模成功的小鼠随机分成5组，每组10只，分别为模型组，壳聚糖原料组(100 mg/kg)，低剂量降解产物组(100 mg/kg)，高剂量降解产物组(200 mg/kg)，拜糖苹治疗组(20 mg/kg)。灌胃1次/d，连续给药28 d。正常组和模型组灌胃生理盐水。
2.2.2 动物标本留取每天观察各组小鼠的进食量、饮水及尿量;给药14 d和28 d后尾尖取血，血糖仪测血糖;实验结束后小鼠被断椎处死，取肝、肾组织，用滤纸吸干表面血迹后称重。
2.3 统计学分析用spss13.0软件进行统计分析，所得数据用 ±s表示，组间差异采用t检验。
3 结果
3.1 纤维素酶的降解过程研究为了考察纤维素酶的催化降解过程，在正交实验确定的最佳组合条件下对壳聚糖进行降解，产物的平均分子量mw随时间的变化情况见图1。
图1 纤维素酶降解过程
图1表明，在开始降解的0.75 h内，产品平均分子量迅速下降。这也证实了纤维素酶对壳聚糖主要进行内切降解反应。随着反应的进行，壳聚糖聚合度减小，产物平均分子量下降趋势变缓。这与产物浓度的增加在一定程度上抑制了降解反应的进行有关。当降解达到3 h后，产物的平均分子量下降趋势非常微弱，维持在2万左右。因此，可在纤维素酶降解3 h后，引入h2o2进行降解。
3.2 h2o2氧化降解工艺条件的确定
3.2.1 温度对降解过程的影响在纤维素酶降解的基础上，不同温度条件下h2o2氧化降解壳聚糖过程见图2。
图2 温度对h2o2降解过程的影响 图2表明，引入h2o2后产物平均分子量迅速下降，降解速率基本上与温度呈正比。这可能是壳聚糖分子内部尚存在少量易断裂 “弱键”，如：少数链节上具有呋喃环结构、存在少数戊糖的环状结构、或存在少数开环的半缩醛链节结构。之后产物平均分子量下降比较平缓，且温度越高进入平缓阶段越早。此外，在反应过程中还发现，在高于80℃条件下降解时，所得产物颜色随着降解时间的延长由淡黄色逐渐转变为褐色，且温度越高变化越明显。分析认为当壳聚糖降解到一定程度后，其空间结构由卷曲状转变成短的直链状，氨基基团活跃性增强，易发生羰氨副反应。为了有效控制副反应消耗具有生物活性的氨基，确定后期h2o2氧化反应温度为75℃、时间为1.5 h。
3.2.2 h2o2用量对降解过程的影响在纤维素酶降解的基础上，质量质量分数为30%h2o2的用量与壳聚糖用量的比值n对降解过程的影响见图3。
图3 h2o2用量对降解过程的影响
由图3可以看出，在反应时间和温度相同的条件下，降解产物的平均分子量随h2o2用量的增加而下降。当用量比增加到0.8以后，下降趋势明显变缓。由此确定后续h2o2的最适用量比值为0.8～1.0(ml/g)。此时，可获得平均分子量约为1 700左右的降解产物。
采用纤维素酶与双氧水复合降解壳聚糖与直接采用双氧水降解相比，双氧水降解时间缩短将近50%，产品平均分子量低且颜色较浅[4]。分析认为，壳聚糖溶液经过纤维素酶初步降解后分子量有了很大降低，呈均相溶液，从而抑制了双氧水可能对部分壳聚糖过度降解。此外，降解时间缩短也很好地限制了副反应的发生。
3.3 降解产物的降血糖活性研究
3.3.1 一般情况的观察实验过程中各组小鼠体重、血糖及内脏重量的变化见表1。表1 小鼠体重、血糖及内脏重量的变化与正常组对照，1p<0.01，2p<0.05;与模型组对照，3p<0.01，4p<0.05
经四氧嘧啶注射造模成功后的糖尿病小鼠，出现饮食量增加、多饮多尿、体毛松散及精神萎靡等症状。未经治疗的模型组“三多”症状尤其突出，体重也明显低于正常组(p<0.05)。低剂量降解产物和拜糖苹治疗组的一般症状得到明显改善，体重与正常组无显著差异。壳聚糖原料和高剂量降解产物治疗组的症状改善居中。
3.3.2 降解产物对糖尿病小鼠血糖的影响与模型组相比，壳聚糖原料治疗组血糖值虽然有所降低，但并不存在显著性差异。原因为壳聚糖本身分子量过大，不能被有效吸收所致。而高、低剂量降解产物和拜糖苹治疗组的14，28 d血糖值明显低于模型组(p<0.01)。其中，低剂量降解产物的降血糖效果甚至优于拜糖苹。由此说明壳聚糖原料经过本工艺降解后具有明显的降血糖生物活性，且起效较快。与正常组相比，单独使用降解产物并不能使血糖降到正常值。
3.3.3 降解产物对糖尿病小鼠内脏的影响由表1中的数据分析可知，除拜糖苹治疗组外(p<0.05)，其它治疗组的肝脏指数虽然高于模型组，但不存在显著性差异。这说明壳聚糖及降解产物对肝脏具有一定保护功能，但效果不显著。同时也证实了临床上广泛使用的拜糖苹降糖药具有对肝脏损害小的优点。对于肾脏，低剂量降解产物治疗组的指数与正常组较接近，而其它治疗组的肝脏指数与模型组接近，明显高于正常组(p<0.01)。可见，使用一定剂量本工艺生产的低聚壳聚糖对糖尿病小鼠进行治疗时，可同时达到保护肝、肾的功效。有关低聚壳聚糖降糖作用机制目前尚不清楚。大多推测为，壳聚糖分子结构中的大量氨基调节机体内ph呈弱酸性，从而增强胰岛素的活性。也有人认为降解后的低聚壳聚糖对动物机体内α-葡萄糖苷酶具有一定抑制作用，阻碍了它从碳水化合物和有关多糖的非还原端切下葡萄糖[5]。根据本研究结果，降解产物的治疗效果与拜糖苹比较接近，而拜糖苹正是α-葡萄糖苷酶的抑制剂，因此，偏向于后者。
4 结论
本研究提出了一种纤维素酶结合双氧水降解壳聚糖的复合降解方法。实验确定最佳工艺条件为：纤维素酶降解时酶糖比为0.2、ph4.6、反应温度为 50℃、时间为3 h，后续h2o2降解时30% h2o2用量与壳聚糖原料的比值为0.8∶1.0(ml/g)、75℃、时间为1.5 h，所得降解产物的分子量约为1 700。降解产物对糖尿病小鼠降血糖研究表明，用量100 mg/kg时具有明显的降血糖生物活性，且起效较快。其功效甚至优于拜糖苹。此外，对糖尿病小鼠进行治疗时，可同时起到保护肝、肾的功效。
因此，该降解工艺不仅有效结合了非专一性酶和双氧水氧化降解的优势，具有成本低，易于工业化，所得产品具有较高的生物活性。
【参考文献】
[1] 魏新林，夏闻水.甲壳低聚糖的生理活性研究进展[j].中国药理学通报，2003,19(6):614.
[2] 林 强，马可力.纤维素酶-过氧化氢降解法制备低聚壳聚糖的研究[j].海洋科学，2003,27(6):7.
[3] 韩永萍，林 强.纤维素酶结合膜法制备低聚壳聚糖[j].化学世界，2007，2:98.
[4] 韩永萍，林 强.过氧化氢降解结合后处理制备壳寡糖的研究[j].北京联合大学学报，2007,21 (2):67.
[5] 魏 涛，唐粉芳，高兆兰.壳聚糖降血脂、降血糖及增强免疫力作用的研究[j].食品科学，2000,21(1):48.
