作者：赵润生 张一盺 苗卉 周桦 吴翟 李昌
【摘要】 目的观察中药消瘀化痰方对非酒精性脂肪肝（nafld）大鼠肝细胞凋亡和肝组织caspase 3蛋白表达的影响，探讨其防治nafld的部分作用机理。方法采用高脂饮食喂饲大鼠复制nafld模型，以东宝肝泰为对照药，运用流式细胞仪观察各组大鼠肝细胞凋亡及肝组织caspase 3蛋白表达的变化，同时采用he染色观察各组大鼠肝组织形态学变化。结果镜下可见模型组大鼠肝脏中度以上脂肪变性，并有少量的肝细胞坏死；流式细胞术分析可见其细胞凋亡率明显增高（p＜0.01），caspase 3蛋白表达fi值增高（p＜0.01）。与模型组比较，各用药组肝脂变程度显著改善，肝细胞的凋亡率明显下降（p＜0.01），caspase 3蛋白表达fi值降低（p＜0.01）。结论消瘀化痰方通过抑制caspase 3蛋白的表达，抑制肝细胞的凋亡，以达到抗脂肪肝作用。
【关键词】 消瘀化痰方 非酒精性脂肪肝 细胞凋亡 caspase 3蛋白
abstract:objectiveto observe the effect of xiao-yu-hua-tan-yin on hepatic apoptosis and caspase3 in nonalcoholic fatty liver rats (nafld) . methodsthe nonalcoholic fatty liver rat model was fed by high fat forage, and dongbaogantai was treated as control group. flow cytometry (fcm) was used to detect the hepatic apoptosis and expression of caspase3, and optical microscope was used to observe the degree of hepatic steatosis. resultsliver cells showed medium or serious steatosis by optical microscope, and a few hepatic necrosis. the rate of cell apoptosis and expression of caspase3 detected by fcm in the model group was significantly increased(p＜0.01). compared with the model group, liver fat cell denaturizing was improved,and the rate of cell apoptosis and expression of caspase3 was significantly decreased in each treatment group(p＜0.01). conclusionxiao-yu-hua-tan-fang can inhibit hepatic apoptosis inhibiting by the expression of caspase3, and protect nonalcoholic fatty liver.
key words:xiao-yu-hua-tan-fang; nonalcoholic fatty liver disease； cell apoptosis; caspase 3 protein
消瘀化痰方为笔者在临床上 治疗 非酒精性脂肪肝（nafld）的效方，既往药效学实验已证实其具有显著的调节血脂和抗脂肪肝作用［1］，但其治疗作用机制尚不十分清楚。wwW.11665.cOM研究发现，肝细胞的凋亡与增生在nafld的病理变化中非常显著［2］。但是，有关中药对nafld肝细胞凋亡影响的研究报道较少，本研究旨在通过观察消瘀化痰方对nafld大鼠肝细胞凋亡及肝组织caspase 3蛋白表达的影响，以探讨其作用机制。
1 材料与仪器
1.1 动物健康雄性sd大鼠50只， 体重180～200 g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，合格证号：scxc（鄂）2004-007。
1.2 药物及试剂
消瘀化痰方的组成与制备：消瘀化痰方由泽泻、丹参、海藻、生黄芪、制半夏、生大黄、郁金、决明子、生山楂、柴胡、炒白术组成，以上药物先用乙醇提取，挥发去酒精，然后将全部药渣加水适量，普通方法煎煮，将提取液与煎煮液混合，浓缩成所需浓度。
东宝肝泰片：通化东宝药业股份有限公司出品，批号为h22024764。实验时用0.5%的羧甲基纤维素钠配制成所需浓度的混悬液。碘化丙啶、rna酶、鼠抗人caspase 3蛋白单克隆抗体、羊抗鼠fitc-igg等均由美国sigma公司提供。
1.3 仪器
facscan-420型流式细胞仪，美国beckton dickinson公司产品。
2 方法
2.1 动物分组与造模50只健康雄性sd大鼠，饲养于18～22℃明暗各12 h的清洁级动物实验室内，正常喂养1周后，随机分为5组，即：正常对照组（简称正常组），模型对照组（简称模型组），消瘀化痰方高、低剂量组（简称高、低剂量组），阳性药（东宝肝泰）对照组（简称对照组）。动物造模参照 文献 ［3］喂饲高脂饲料，高脂饲料由1.5%胆固醇、0.5%胆盐、10%猪油和88%基础饲料制成。除正常组喂饲普通饲料外，其余各组均给予高脂饲料，连续9周。
2.2 给药方法及标本处理大鼠造模的同时，各组分别给予相应药物灌胃，给药剂量按药理实验方法学 计算 ，消瘀化痰方高、低剂量组分别按43.34，21.67 g/kg体重的标准灌服，对照组按0.9 g/kg体重的标准灌服，正常组和模型组灌服生理盐水。各组1次/d灌胃，每次用药体积均按1 ml/100 g计算。实验9周末，最后1次给药后禁食12 h麻醉状态下迅速剖取肝脏，在肝脏最大叶距边缘0.5 cm处取少许肝组织，生理盐水洗净血液，滤纸吸干水分，70％乙醇溶液固定，4℃冰箱冷贮待检。另在相同部位取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的肝组织浸泡于4％多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片，he染色，光镜下观察肝组织形态变化。
2.3 指标检测
2.3.1 肝组织形态学观察取大鼠部分肝组织用4% 的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，he染色，光学显微镜观察。
2.3.2 肝细胞凋亡及肝组织caspase 3蛋白表达的流式细胞术分析单细胞悬液的制备：取已固定肝组织放于120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，轻搓组织，边搓边以pbs液冲洗，直至将组织搓完。将平皿中的混悬液用300目筛网过滤去除细胞团块，收集细胞悬液，1 000 r/min，离心3 min，弃上清，保留沉淀，加入pbs 0.3 ml，稀释混匀后，将单细胞悬液分成2份，调整每份样品的细胞数为1×106，用于检测肝细胞凋亡情况。
细胞凋亡dna含量染色：采用pi一步插入性dna定量荧光染色方法，染液中含pi 50 μg/ml，rna酶100 μg/ml，triton-x 100 1.0%。取上述制备的单细胞悬液1份，加入pi－dna荧光染色液1 ml，置4℃冰箱染色30 min，以500目筛网过滤后上机检测。测量的数据输入 计算 机，应用expo32adc软件进行免疫荧光数据分析，用muticycleav分析软件对dna细胞周期拟合分析。采用barlogie的细胞图解法分析，将处于不同时期的细胞分为3部分，即：g0/g1期、s期、g2/m期，根据dna含量直方图，由计算机计算出各时相的分布比率，并计算细胞增殖指数（pi）。为保证仪器的精度和实验条件的稳定性，检测前以flow-checktmfluorpheres（10 μm）荧光微球（ref6605359.be-ckman couiter，inc.fullerton，ca 92835）作为标准样品调整仪器cv值在2％以内。
caspase 3蛋白免疫荧光样品的制备：将1×106个细胞以pbs洗涤2次，2 min/次，离心2 min，弃上清液，加入1∶100的鼠抗人caspase 3蛋白单克隆抗体100 μl，30℃温育30 min，用pbs离心洗涤2次，弃上清液，加入1∶100的羊抗鼠fitc-igg 100 μl，37℃温育30 min，离心洗涤2次取上清液，除去未结合的多余荧光抗体，上机前加入1.0 ml pbs液，经400目滤网过滤即可上机检测。
2.4 资料计算方法细胞凋亡指数（apopyotic index，ap）表示细胞凋亡程度，计算10 000个细胞中出现的凋亡细胞数，并计算出百分比。细胞增殖指数（proliferation index，pi）表示细胞增殖活性，计算方法为：pi=（s+g2/m）/（g0/g1+s+g2/m）×100%。免疫荧光指数（fluorescence index，fi）表示蛋白表达水平，计算方法为：fi=样品蛋白表达的平均荧光强度/正常对照样品平均荧光强度。
2.5 统计学处理数据用±s表示，采用单因素方差分析和q检验。统计分析用spss软件进行处理，显著性检验以0.05和0.01为标准。
3 结果
3.1 肝组织形态学改变光镜下可见，正常组大鼠肝组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，中央静脉大而壁薄，肝细胞排列成肝索，在中央静脉周围呈放射状分布，细胞呈多边形。模型组大鼠肝细胞中度细胞水肿，少量的肝细胞坏死，多数肝细胞内可见大小不等、数量不一的脂滴空泡（脂肪变性），重度变性者，脂滴空泡融合，呈现中至重度脂肪变性，但未见明显的纤维化改变。各 治疗 组动物肝小叶和肝血窦结构清晰，高、低剂量组肝细胞内脂滴空泡基本消失，对照组中少量的肝细胞内仍有脂滴空泡，并有轻度的细胞水肿。
3.2 肝细胞凋亡及调控基因蛋白caspase 3的流式细胞术分析与正常组比较，模型组大鼠肝细胞凋亡率明显增高（p＜0.01），caspase 3蛋白表达fi值明显增高（p＜0.01）。经用药干预后，高、低剂量组及对照组肝细胞凋亡率明显降低（p＜0.01），caspase 3蛋白表达fi值明显降低（p＜0.01）。说明随凋亡率增加，caspase 3蛋白表达量也增加。各治疗组中高、低剂量组的肝细胞凋亡率和caspase 3蛋白表达fi值均低于高剂量组（p＜0.05或p＜0.05）。见表1。表1 各组大鼠肝细胞凋亡率和肝组织caspase3表达fi值的比较（略）与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01；与对照组比较，△p<0.05，△△p<0.01；n=10
4 讨论
nafld在古代医籍中无此病名及相关的描述，根据其临床表现可归属于中医的 “肝痞”“胁痛”“肝着”“肝壅”“痰方”等病证的范畴。笔者认为nafld多由饮食失节，恣食肥甘厚味，损伤脾胃，使其运化失常，酿生痰浊，聚集体内，痰阻气滞，肝失调达，血脉瘀阻，痰瘀结于胁下，形成本病。故痰瘀互结、肝脾失调为其主要病机，消痰化瘀、健脾疏肝为其有效治法。因此，精心筛选相关药物组成消瘀化痰方，经临床应用疗效满意。方中选用泽泻、制半夏、海藻除水湿、消痰浊；丹参、郁金活血通络，祛肝经之瘀，增强肝脏血运；生大黄通腑导滞，降浊祛脂，与泽泻配用，分流疏导，使邪有去路；生山楂祛瘀消积；柴胡、决明子疏肝利胆，清肝经郁热；生黄芪、炒白术补气健脾，以助痰瘀的运除，而且也体现了“见肝之病，当先实脾”的治疗法则。诸药合用则清降痰浊瘀积，调节肝脾功能，从而达到抗脂肪肝的目的。
细胞凋亡是受细胞内源性基因、酶和信号传导途径调控的一个“瀑布式”激活过程。近年人们发现了一类在细胞凋亡的信息传递中具有重要作用的蛋白酶家族caspase，目前已发现该家族中有16个成员，caspase 3则是这一家族的重要成员，它处于细胞凋亡过程中的关键地位，在各种生理和病理因素刺激下经过多因子复杂的相互作用后，其底物被激活降解产生终末事件，引起细胞形态学上特征性的凋亡改变，加重组织或器官的功能损害。正常情况下，caspase 3以无活性的酶原形式存在，当机体受到内部或外界因素刺激时被激活，caspase 3裂解为活性体，激活凋亡的级联反应。caspase 3激活后可诱导细胞凋亡的发生，在细胞凋亡早期的启动与执行过程中起着重要作用。史洪涛等［4］研究发现，caspase 3介导的肝细胞凋亡是脂肪肝发病过程中肝细胞损伤的重要机制。
本实验结果显示，在凋亡率最高的模型组，caspase 3基因表达量最高；正常组caspase 3基因表达量最低，说明caspase 3蛋白的上调，使细胞凋亡的趋势增强，在nafld的发生中可能有一定意义。经过用药干预，各治疗组caspase 3蛋白均明显下降，细胞凋亡趋势减弱，以消瘀化痰方高、低剂量组较为明显，其效果优于阳性对照组。说明消瘀化痰方可通过抑制caspase 3蛋白的表达，减少肝细胞的凋亡，加速肝细胞的dna合成及分裂增殖，以达到减轻nafld大鼠的肝脏脂肪变性、恢复肝脏正常功能的作用。
【 参考 文献 】
［1］苗 卉，魏翠萍，张一盺，等.消瘀化痰饮对非酒精性脂肪肝大鼠脂质代谢和肝组织形态学的影响［j］.河北中医药学报，2007，22（2）：3.
［2］郭秀丽，任 莉，梁丕霞， 等.非酒精性脂肪肝发病机制［j］.医师进修杂志，2005，28(9):53.
［3］戴 宁，曾民德，李继强，等.复方中药抑制非酒精性脂肪肝肝细胞色素p450ⅱe1表达的实验研究［j］.
