作者：朱家校，何伟，李勇，马建春
【摘要】 目的 建立通络止痛贴剂中胡椒碱含量测定方法。方法 采用反相高效液相色谱法测定。色谱柱：akasilc18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：乙腈质量分数0.1 %磷酸溶液(体积比40∶60);检测波长：343 nm;柱温：30 ℃;流速：1.0 ml/min。结果 胡椒碱在0.010 0～0.301 2 μg范围内与峰面积线性关系良好，r=0.9999，平均加样回收率为100.62 %，rsd=1.34%。结论 测定方法操作简便、准确，可用于控制通络止痛贴剂中胡椒碱的含量。
【关键词】 通络止痛贴剂;胡椒碱;反相高效液相法;含量测定
(institute of materia medica，guangdong pharmaceutical college/guangdong provincial key laboratory of advanced drug delivery，guangdong pharmaceutical college,guangzhou,guangdong 51006,china)abstract:objective to establish a determination method for piperine in tongluo zhitong patch. methods reversephase hplc with akasilc18 column was applied. the chromatographic conditions were as follows:acetonitrile0.1% phosphoric acid solution (40∶60)with a flow rate of 1.0 ml/min,uv detection wavelength at 343 nm，and column temperature at 30 ℃. results the linear range of piperine was 0.010 0-0.301 2 μg(r=0.999 9) with the average recovery of 100.62% (rsd=1.34 %). conclusion this method is simple and accurate，and can be used for the quality control of piperine in tongluo zhitong patch.
key words:tongluo zhitong patch; piperine;rphplc; content determination
通络止痛贴片处方由荜茇、藁本、冰片等中药组成，具有疏风通络、利窍止痛的功效，临床用散剂外敷 治疗 偏头痛，疗效确切。www.11665.com本文根据方中药物有效成分的理化性质、药理作用及临床用药特点，将其研制成贴剂。荜茇为本品方中的君药，胡椒碱是该药的主要有效成分，因此，本文采用高效液相色谱法对制剂中胡椒碱进行了含量测定，经方法学研究，胡椒碱在所选用测定条件下能够得到较好地分离，专属性强，阴性无干扰，可作为该制剂的含量控制指标。
1 仪器与试药
1.1 仪器
dionex ultimate 3000高效液相色谱仪(光电二极管阵列检测器、chromeleon色谱工作站);bs224s型 电子 分析天平(北京sartorius公司);uv1101型紫外分光光度计(上海天美 科学 仪器有限公司);lxjⅱ离心沉淀机(上海医用分析仪器厂);kq250e型医用超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 试药
胡椒碱对照品(批号0775200203，供含量测定用，购自 中国 药品生物制品检定所);通络止痛贴剂(规格：2.5 cm×2.5 cm，批号：100325、100326、100327，广东药学院药物研究所制备);乙腈为色谱醇;其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：akasilc18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：乙腈质量分数0.1%磷酸溶液(体积比40∶60);检测波长：343 nm;柱温：30 ℃;流速：1.0 ml/min，进样量20 μl;理论塔板数按胡椒碱计应不低于5 000。
2.2 样品溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取胡椒碱对照品10.04 mg，加无水乙醇溶解并定容至100 ml量瓶中，作为对照品储备液;精密吸取对照品储备液1 ml，加无水乙醇稀释并定容至10 ml，作为对照品溶液(0.010 04 mg/ml)。
2.2.2 供试品溶液的制备 取通络止痛贴剂1贴，除去保护层，剪碎，置干燥具塞磨口瓶中，加体积分数5%冰醋酸无水乙醇溶液25 ml，密塞，超声提取(300 w，45 khz)30 min，滤过，残渣同法提取两次，合并滤液， 用无水乙醇定容至100 ml， 精密吸取2 ml，加无水乙醇定容至5 ml，摇匀， 用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液作为供试品溶液。
2.2.3 阴性对照品溶液的制备 按处方比例制备不含荜菝的阴性样品，按“2.2.2”项方法制成不含荜茇的阴性对照品溶液。
2.3 专属性试验
分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件测定。胡椒碱色谱峰保留时间约为27.4 min，阴性对照品在胡椒碱色谱峰相应位置无干扰峰，对测定无干扰。结果见图1。
2.4 标准曲线的绘制
精密吸取胡椒碱对照品溶液(0.010 04 mg/ml)1、5、10、15、20、30 μl，注入液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件测定胡椒碱色谱峰峰面积，以微克数为横坐标(x)，峰面积积分值为纵坐标(y)，得回归方程：y=51.218x-0.1407，r=0.999 9，表明胡椒碱在0.010 0～0.301 2 μg范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验
精密吸取胡椒碱对照品溶液20 μl， 注入液相色谱仪，重复进样6次，测定胡椒碱色谱峰峰面积，rsd为0.323%(n=6)，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
取同一批号贴剂(批号：100325)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 μl，注入液相色谱仪，测定胡椒碱峰面积，然后分别在0、2、4、8、12、24 h再进样测定。结果表明，供试品在24 h内稳定性良好，rsd为0.599%(n=6)。
2.7 重复性试验
取同一批号贴剂(批号：100325)5份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样20 μl，测定胡椒碱峰面积， 计算 含量，胡椒碱平均含量为2.625 mg/贴， rsd为1.334%(n=5)，表明方法重复性好。
2.8 回收率试验
取干燥具塞磨口瓶9只，平行分为3组，每组分别加入0.525 mg/ml胡椒碱对照品溶液4、5、6 ml(相当于胡椒碱2.1、2.625、3.15 mg)，挥干无水乙醇;另取按处方量制备的不含药物的空白贴剂9贴，除去保护层，分别置于上述磨口瓶中，按照“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，进样20 μl测定，并计算回收率，结果见表1。
2.9 样品含量测定
取不同批号通络止痛贴剂，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算胡椒碱含量。结果3个批号(100325、100326、100327)样品中的胡椒碱平均含量分别为2.6171、2.5927、2.6249 mg/贴(n=3)。表1 胡椒碱加样回收率试验结果
3 讨论
3.1 供试品溶液的制备中，进行了提取溶剂的选择，分别考察无水乙醇[1]、甲醇[2]、乙酸乙酯[3]等溶剂对通络止痛贴剂中胡椒碱的提取率，但几种溶剂提取率均较低，而采用冰醋酸无水乙醇混合溶液作为提取溶剂，胡椒碱有较高的提取率，液相色谱分析无杂质峰干扰。
3.2 按照《 中国 药典》2010版一部荜茇项下含量测定方法[4]，以甲醇水(体积比77∶23)作为流动相，胡椒碱对照品仅出现1个不对称的色谱峰(图2)。经多次试验摸索，以乙腈质量分数0.1%磷酸溶液(体积比40∶60)作为流动相，胡椒碱峰形好，分离度高，胡椒碱对照品色谱图出现3个色谱峰(见图1)。由于胡椒碱对照品色谱图出现了3个色谱峰，使得胡椒碱的定量不准确。本实验根据3个色谱峰峰面积的比例，折算出胡椒碱对照品实际称取量及实际浓度，从而减小了胡椒碱含量测定误差。
【 参考 文献 】
[1] 何振梅，徐彦贵，朱静，等.反相hplc法测定胃痛散胶囊中胡椒碱的含量[j].天津药学，2001(5)：214-215.
[2] 姚征，顾建刚，储戟农.高效液相色谱法测定荜芨止痛酊中胡椒碱的含量[j].
