作者：饶斯清，陈楚雄，杨梦心，温预关
【摘要】 目的 建立快速、灵敏的托莫西汀人体内血药浓度的高效液相色谱串联质谱测定法，并对12名健康志愿者口服盐酸托莫西汀胶囊后在人体内的药动学过程进行研究。方法 12名健康志愿者单剂量口服给药20 mg后，分别于给药前和给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h采集血样。用高效液相色谱串联质谱法测定血浆中托莫西汀的浓度，并采用das药动学程序对试验数据进行处理，求算有关药动学参数。结果 单剂量口服给药盐酸托莫西汀胶囊20 mg后，其平均血药质量浓度-时间曲线拟合符合二室模型，t1/2、tmax、cmax、auc0-24、auc0-∞分别为(4.55±0.79)h、(1.33±0.48)h、(225.18±48.53)μg·l-1、(971.34±219.52)μg·l-1·h和(992.60±229.93) μg·l-1·h。结论 建立的托莫西汀人体内血药浓度测定方法灵敏、可靠、简便，盐酸托莫西汀胶囊单剂量给药后在 中国 健康人体内的药动学行为与国外 文献 报道基本一致。
【关键词】 盐酸托莫西汀胶囊;高效液相色谱串联质谱法;药动学
abstract:objective to develop a rapid and sensitive hplc/ms method for the analysis of atomoxetine in human plasma,and study the pharmacokinetics characteristics of atomoxetine hydrochloride capsules after a single oral dose of 20 mg in healthy volunteers. methods a single oral dose of 20 mg atomoxetine hydrochloride capsules was given to 12 healthy volunteers. blood samples were taken for detecting plasma concentration before dosing and at 0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，5,6，8，10，12，24 h after administration. hplc/ms/ms method was used to assay the concentration of atomoxetine in plasma. the pharmacokinetic parameters were evaluated with das program. results the concentrations of atomoxetine in plasma were fitted with a twocompartment model. the main pharmacokinetic parameters of atomoxetine by oral administration were as follows: t1/2(4.55±0.79)h ，tmax(1.33±0.48)h，cmax(225.18±48.53)μg·l-1，auc0-24(971.34±219.52)μg·l-1·h，auc0-∞(992.60±229.93) μg·l-1·h.conclusion the analytical method appeared to be accurate,sensitive and convenient,and the pharmacokinetic characteristic of atomoxetine hydrochloride capsules was consistent with the literature data.
key words:atomoxetine hydrochloride capsules;hplc/ms/ms;pharmacokinetics
托莫西汀(atomoxetine，商品名：择思达)是第1个用于 治疗 注意缺陷多动障碍(attention deficit hyperactivity disorder，adhd)的非兴奋性药物，目前已经在美国、英国、中国等多个国家上市并应用[1]。wWW.11665.COm托莫西汀是一种去甲肾上腺素再摄取抑制剂，能选择性抑制突触前胺泵对去甲肾上腺素的再摄取，增强去甲肾上腺素的翻转效应，从而改善多动症的症状，间接促进认知的完成和注意力的集中[2,3]。有关托莫西汀的药动学研究，国内未见中国人体内托莫西汀药动学研究的文献报道。本试验对口服盐酸托莫西汀胶囊后在人体内的药动学过程进行研究。
1 仪器与材料
1.1 仪器 agilent 1200高效液相色谱仪(美国agilent)，包括g1379b自动脱气机，g1310a自动调配四元泵，g1329a自动进样器，g1316a可调柱温箱;agilent 6410 triple quad lc/ms(美国agilent);xw80a型旋涡混合器(原上海医科大学仪器厂);bp110s型 电子 分析天平(德国sartorius);mikro1224型高速离心机(德国hettich);111型真空干燥箱(德国mmmgroup)。
1.2 试药 盐酸托莫西汀胶囊(每片含托莫西汀10 mg，批号：20080901，有效期至2010年8月，由海南某制药厂提供);盐酸托莫西汀对照品(美国sigma公司，批号：1004-0801002);内标物为盐酸氟西汀(浙江埃森医药有限公司，批号：a0907)。甲醇(默克公司，色谱纯);甲酸铵(美国sigma公司，质谱纯);甲酸(迪马公司，色谱级);碳酸氢钠(广州化学试剂厂，分析纯);水为重蒸去离子水。
2 方法与结果
2.1 对照品和内标溶液 分别精确称取盐酸托莫西汀、盐酸氟西汀对照品11.7 mg和11.4 mg(分别含托莫西汀、氟西汀各10 mg)，分别置10 ml容量瓶中，用流动相溶解定容至刻度，即配制成质量浓度为1 g·l-1的贮备液，贮存于4 ℃冰箱避光保存备用。试验前按试验所需稀释成相应浓度的标准工作液。另稀释配置质量浓度为3 000 μg·l-1的内标氟西汀流动相溶液。
2.2 受试者选择
试验前，试验方案和知情同意书经本院伦理委员会审批同意后，受试者签署知情同意书，并均进行常规体检和实验室检查(尿常规、血常规、肝功能、肾功能、心电图和胸透等)，合格者入选为受试者。有15名志愿者签署知情同意书，经全面体格检查后，胸透、心电图、血压、血尿常规及肝肾功能等各项指标均正常者12名入组，男女各半，年龄为19～27岁，平均(25±4)岁，身高160～178 cm，平均(168±6)cm，体质量50～62 kg，平均(56±6)kg。试验后，受试者体格复查。受试期间1个月内未服用任何其他药物，且在1个月内禁烟和禁酒。
2.3 给药方案
12名受试者禁食12 h后，于试验日早晨7：30空腹开始试验。受试者一次性口服受试制剂20 mg，用200 ml温开水送服，服药4 h后给予统一低脂标准餐。给药后观察受试者的反应，记录受试者主诉的不良反应。
2.4 血样采集
每例受试者均于用药前在前臂静脉安置留置针抽血，用药前采空白血4 ml，再分别于安置留置针给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h分别采血3 ml/次，置肝素抗凝的试管中，3 000 r/min离心5 min，取血浆，分两份于-30 ℃下冰柜保存，待用。
整个试验过程均在医师和护士监护下进行，并于给药后不同时间监测受试者的反应，及时处理和记录试验过程中发生的不良反应。试验期间禁用其他药物及含咖啡因类饮料、烟和酒。
2.5 样品测定
2.5.1 色谱条件 色谱柱：agilent eclipse plus c18(150 mm×2.1 mm，5 μm);流动相：乙腈(含0.2%甲酸)水(含0.02 mol·l-1甲酸铵)(体积比80∶20);流速：0.3 ml·min-1;柱温：40 ℃。质谱条件：电喷雾电离源(esi)，正离子化，扫描方式为选择性离子监测，托莫西汀m/z 256.1→44.1，氟西汀m/z 310.1→44.2，毛细管电压4 000 v，喷雾气压力206.85 kpa，气体流速8 l·min-1，气体温度350 ℃，碰撞能量8单位，裂解电压135 v，四级杆捕捉时间0.2 s， 电子 倍增器300 v。进样量为5 μl。
2.5.2 样品处理 取含药血浆0.5 ml置10 ml的带塞磨口锥形玻璃离心管中，加入3 000 μg·l-1的氟西汀甲醇溶液50 μl，快速振荡3 s，加饱和碳酸氢钠水溶液0.2 ml，快速振荡15 s，再加醋酸乙酯二氯甲烷(体积比4∶1)3 ml，密塞，旋涡振荡1 min，3 000 r·min-1离心10 min，吸取有机层置3 ml的带塞磨口锥形玻璃离心管内，42 ℃真空至干。进样前以200 μl流动相复溶，3 500 r·min-1离心10 min，吸取上清液5 μl进样。
2.5.3 方法专属性 分别取6名受试者的空白血浆0.5 ml 置10 ml的带塞锥形玻璃离心管中，除不加内标外，按“2.5.2”项依法操作，进样5 μl，获得空白血浆样品的色谱图，如图1(a);将一定浓度的对照品溶液和内标溶液加入空白血浆中，依同法操作获得相应的色谱图1(b)，托莫西汀、氟西汀的出峰时间分别约为1.24 min和1.26 min;取健康受试者给药后收集的血浆样品，依同法操作，得色谱图1(c)。结果表明，空白血浆中内源性物质不干扰托莫西汀及内标氟西汀的测定。
2.5.4 标准曲线的制备和最低定量限的确证 取空白血浆0.5 ml，分别加入质量浓度为10、20、50、100、500、1 000、5 000、10 000和15 000 μg·l-1的托莫西汀对照品溶液50 μl，振荡3 s，使血浆药物质量浓度分别相当于1、2、5、10、50、100、500、1 000和1 500 μg·l-1，其余按“2.5.2”项处理。经hplc/ms/ms分析，以托莫西汀峰面积与内标峰面积之比(y)为纵坐标，以血浆托莫西汀浓度与内标浓度之比(x)为横坐标，权重系数为1/x2，得回归方程为y=0.5821x-2.5814×10-4，r=0.997 5(n=9)，表明血浆中托莫西汀质量浓度在1～1 500 μg·l-1范围呈良好的线性关系。血浆样品托莫西汀定量下限质量浓度为1 μg·l-1(s/n>14)，平行对5个质量浓度为1 μg·l-1的含药血浆样品处理后进行色谱分析，其方法回收率为101.82%，rsd为4.96%。
2.5.5 回收率及精密度试验 按“2.5.4”项方法分别配制低(2 μg·l-1)、中(100 μg·l-1)和高浓度(1 000 g·l-1)的托莫西汀血浆溶液各15份，分为3批，每批5份，并与每批的标准曲线同时进行，依“2.5.2”项方法处理后取5 μl进样，测定精密度，并 计算 质控样品的测得浓度，与配制浓度对照，求得方法回收率(见表1)。同法以空白血浆，除不加标准系列溶液和内标外，按“2.5.2”项方法处理后，再加入相应浓度的托莫西汀和氟西汀，取5 μl上清液进样，以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。结果低(2 μg·l-1)、中(100 μg·l-1)、高浓度托莫西汀(1 000 μg·l-1)的提取回收率分别为84.78%、85.49%和86.04%。精密度和提取回收率见表1。表1 回收率与日内、日间精密度
2.5.6 稳定性试验 按“2.5.4”项方法分别配制低(2 μg·l-1)、中(100 μg·l-1)、高浓度(1 000 μg·l-1)的质控血浆样品，每个浓度21份样品分析，分为3组。分别考察了样品经室温放置1 h和24 h，冻融1次和3次，-20 ℃冻存1、12、24 d的稳定性。中、高2个浓度样品3种条件检测结果的rsd均<15%，低浓度样品3种条件检测结果的rsd均<20%。
2.5.7 质控样品的监控 按“2.5.4”项方法分别配制低(2 μg·l-1)、中(100 μg·l-1)、高浓度(1 000 μg·l-1)的托莫西汀血浆样品置-20 ℃冻存备用，此即为血浆质控样品。检测每批血浆样品前需做随行标准曲线，并随行检测质控样品低、中、高3个浓度，每个浓度至少两样本，并应均匀分布在未知样品测试顺序中;结果质控样品检测结果其相对标准偏差均在15%内(低浓度在20%)。
2.6 血浆样品中药物质量浓度的测定及药动学参数的计算
将12名健康志愿者单剂量给药20 mg受试制剂和参比制剂后的血药浓度列表并计算均值和标准差，绘制平均血药质量浓度时间曲线(见图2);用das程序对数据进行拟合，以实测值计cmax、tmax;以末端相血药浓度的对数值对时间进行回归，求得斜率k，再求算t1/2;运用梯形法求算auc0-24和auc0-∞，主要药动学参数见表2。将血药质量浓度时间数据用pks程序处理，结果平均血药质量浓度时间曲线符合以权重为1/c拟合的口服给药二室模型。
2.7 不良反应情况
12名受试者在试验过程中，均未出现不良反应，试验后进行体格复查，胸透、心电图、血压、血尿常规及肝肾功能等各项指标均正常。表2 12名健康志愿者给药后的主要药动学参数
3 讨论
人血浆中托莫西汀浓度检测方法国内外未见 文献 报道。本文曾采用醋酸乙酯、乙醚、三氯甲烷、正己烷以及醋酸乙酯二氯甲烷(体积比4∶1)作为提取液，通过比较发现醋酸乙酯二氯甲烷(体积比4∶1)混合提取液提取率最高，杂质也较少，故采用此混合提取液。本文建立的串联质谱检测方法，定量检测限达到1 μg·l-1，满足人体药动学研究要求。
盐酸托莫西汀胶囊人体药动学研究未见国内文献报道。单次口服20 mg后t1/2约为4.55 h，cmax约为225.18 μg·l-1，tmax为1.33 h，个体差异大，可能与cyp2d6存在个体差异有关，与文献[1-3]报道相似，用药时应引起医生注意。
【 参考 文献】
[1] 杜亚松. 治疗 adhd的新药-托莫西汀[j].
