作者：李园，陈桐楷，林华庆，张蜀，邓红
【摘要】 目的 建立石杉碱甲固体脂质纳米粒(hup asln)包封率的测定方法。方法 分别采用透析法、超滤法分离固体脂质纳米粒和游离药物,以高效液相色谱法测定石杉碱甲的含量。结果 超滤法能有效地将石杉碱甲固体脂质纳米粒与游离石杉碱甲分离，回收率为98.09%，测得3批样品的平均包封率为57.63%。结论 超滤法方便快捷，结果准确，适用于石杉碱甲固体脂质纳米粒的包封率测定。
【关键词】 石杉碱甲;固体脂质纳米粒;包封率;透析法;超滤法
abstract:objective to establish a method for the determination of the entrapment efficiency of solid lipid nanoparticles loading huperzine a (hup asln). methods the solid lipid nanoparticles and free drugs were separated by ultrafiltration and dialysis with hplc for the assay of hup a. results free drugs could be effectively separated from the hup asln by ultrafiltration. the average entrapment efficiency of three batches of hup asln was 57.63%,with the recovery of 98.09%.conclusion it convenient,sensitive and accurate with ultrafiltration,and can be used to determine the entrapment efficiency of hup asln.
key words:huperzine a; solid lipid nanoparticles; entrapment efficiency; dialysis; ultrafiltration
石杉碱甲(huperzine a,hup a)是从中草药蛇足石杉(千层塔)中分离出来的天然产物，是一种高效、可逆的胆碱酯酶抑制剂，能促进记忆再现和增强记忆保持。WWw.11665.CoM据 文献 报道，石杉碱甲 治疗 阿尔茨海默氏病有确切的临床疗效，是目前国际上治疗老年痴呆较为理想的候选药物[1]。但石杉碱甲生物半衰期短，口服或注射后会出现不良反应而影响其疗效[2]。近年来，固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，sln)作为一种给药新载体，在不同给药途径中具有很大的开发潜力和市场前景。将hup a包封于sln内，再制成经皮给药制剂，能增加药物在局部组织的积累并起到持续释药的作用，相对减少全身吸收以避免不良反应。
sln的药物包封率是处方工艺筛选与质量评价的重要指标，也是其发挥疗效的关键。本文采用高压乳匀法制备了石杉碱甲固体脂质纳米粒(hup asln)，分别用透析法、超滤法测定其包封率，并分别对这两种测定方法进行比较和方法学考察，优选出准确度高的hup asln包封率测定方法。
1 仪器与试药
ultimate 3000型液相色谱仪(美国戴安公司);ns1001l型高压均质机(意大利niro soavi spa. 公司);zetasizer 3000hs 型激光粒度仪(英国malvern公司)。
石杉碱甲原料药(浙江万邦药业有限公司，批号:20090402);透析袋(截留分子量8 000～13 000，上海百博有限公司);单硬脂酸甘油酯(天津市百世化工有限公司);超滤离心管(截留分子量50 000，sartorius);泊洛沙姆188(德国basf公司);油酸(天津市大茂化学试剂厂);甲醇、乙腈为色谱纯;其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 hup asln的制备[3,4]
称取1.5 g泊洛沙姆188，加适量蒸馏水超声分散至完全溶解，将其置于70 ℃恒温水浴中，作为水相;称取处方量的主药与混合脂质材料(单硬脂酸甘油酯和油酸)，主药和脂质材料比例为1∶30(质量比)，在恒温磁力搅拌器70 ℃条件下充分熔融，作为油相。在磁力搅拌下(1 000 r·min-1)，将水相滴加到油相中，保持恒温搅拌一定时间后停止加热，并继续搅拌一定时间，得初乳。将初乳在均质压力70 000～90 000 kpa下，通过高压均质机乳匀4次，即得hup asln。同法制备3批，置于4 ℃冰箱保存，备用。同法制备空白sln。
2.2 色谱条件
色谱柱：agilent c8 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：0.02 mol·l-1磷酸二氢钾(ph值3.90)乙腈 (体积比86∶14);进样量：20 μl;检测波长：310 nm;流速：0.8 ml·min-1。
2.3 专属性试验
精密量取空白固体脂质纳米粒及含药固体脂质纳米粒各1 ml，用体积分数80%甲醇溶液超声破乳后定容至50 ml容量瓶中，离心，取上清液过滤，按上述色谱条件分别进样，结果见图1。由图1可见，石杉碱甲峰与相邻峰分离良好，保留时间约为6.3 min，辅料对药物的测定无干扰。
2.4 线性关系考察
精密称取石杉碱甲对照品，用体积分数20%的甲醇溶液溶解后配成质量浓度为500.0 μg·ml-1的储备液。分别精密移取储备液适量，用体积分数20%甲醇稀释成质量浓度为5.0、10.0、25.0、40.0、50.0 μg·ml-1的系列对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样。以峰面积(a)对质量浓度(ρ)作线性回归，得回归方程为a=0.794ρ-0.1225 (r=0.999 9)，表明石杉碱甲在5.0～50.0 μg·ml-1内线性关系良好。
2.5 精密度试验
取“2.4”项下5.0、25.0、50.0 μg·ml-1的溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，于1 d各重复进样5次， 计算 日内精密度，结果低、中、高3种浓度的rsd分别为0.28%、0.03%、0.07%;连续5 d重复进样5次，计算日间精密度，rsd分别为0.43%、0.11%、0.19%。表明精密度符合方法学要求。
2.6 稳定性试验
精密吸取“专属性试验”项下的含药供试品溶液20 μl，分别于0、2、4、6、8、24 h进样，按“2.2”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。结果rsd为0.56%，表明样品在24 h内稳定。
2.7 回收率试验
精密配制低、中、高3个浓度(相当于hup a质量浓度为400.0、500.0、600.0 μg·ml-1)的hup a 20%甲醇溶液，分别与空白sln按1∶1比例混合得到混合溶液。精密移取上述混合溶液各1 ml，每个浓度各5份，分别置10 ml容量瓶中，加适量体积分数80%的甲醇溶液超声20 min后定容，然后经3 000 r·min-1离心机离心10 min，取上清液过滤后按“2.2”项下色谱条件进样，计算回收率，结果见表1。
2.8 hup asln中hup a含量的测定
精密移取hup asln 1 ml，置50 ml容量瓶中，加适量体积分数80%的甲醇溶液超声20 min后定容，然后经3 000 r·min-1离心机离心10 min，取上清液过滤后按“2.2”项下色谱条件进样，用外标法计算样品含量。测得3批样品的含量分别为99.53%、99.78%、99.81%。表1 回收率试验
2.9 hup asln包封率的测定
2.9.1 透析法
2.9.1.1 透析介质的选择
透析法中透析介质一般以水为主体，因hup a不溶于水，易溶于甲醇，故选择透析介质时考虑使用不同浓度的甲醇水溶液。因甲醇对sln的结构有破坏作用，故避免使用高浓度甲醇。预试验中发现20%的甲醇水溶液对hup a有一定的溶解能力，可以满足药物游离出来的条件。且该体积分数的甲醇对sln的外观与结构无明显影响，不会破坏粒子的乳化层而影响结果的准确性。故选择20%的甲醇水溶液作为透析介质。
2.9.1.2 透析条件的确定[5]
精密移取hup asln 1 ml,置已处理好的透析袋中，两端扎紧后作为内相，再移取20%的甲醇水溶液10 ml作为透析介质，同法做8份样品。在25 ℃、120 r·min-1条件下，将样品置于摇床中，分别于0.5、1、1.5、2、3、4、5、6 h时间点各取出1份样品，取透析介质过滤后，按“2.2”项下色谱条件进样， 计算 其中游离药物含量，结果表明在2 h后达到透析平衡。
2.9.1.3 方法回收率试验
配制低、中、高3个浓度(分别相当于hup a质量浓度为400.0、500.0、600.0 μg·ml-1)的hup a 20%甲醇溶液，分别与空白sln按1∶1比例混合得到混合溶液。精密移取上述混合溶液各1 ml，在25 ℃、120 r·min-1条件下，将其置于摇床中平衡2 h，取透析外相过滤后，测定游离药物含量，计算回收率。结果见表2。
2.9.1.4 包封率的测定
精密移取hup asln 1 ml，置已处理好的透析袋中，两端扎紧后作为内相，再移取20%的甲醇水溶液10 ml作为透析介质。25 ℃、120 r·min-1条件下，置于摇床中，透析2 h，然后取透析介质过滤，按“2.2”项下色谱条件测定，计算其中游离药物的量(wf);同时精密移取hup asln 1 ml,同“2.8”项下测定hup asln中总药物的含量，计算总药物的量(wo)，并计算包封率[包封率=(wo-wf)/wo×100%]。用上述方法平行测定3批样品的包封率为54.24%、52.08%、53.83%，平均值为53.38%。
2.9.2 超滤法
2.9.2.1 超滤离心管对sln透过能力的考察
取hup asln适量置超滤离心管中离心30 min，转速为4 000 r·min-1，收集滤液并测定粒径。滤液中未检测到sln，表明滤液中无sln存在，超滤离心管能达到完全截留sln的效果。
2.9.2.2 方法回收率试验[6]
配制低、中、高3个浓度(相当于hup a质量浓度为400.0、500.0、600.0 μg·ml-1)的hup a 20%甲醇溶液，分别与空白sln按1∶1比例混合得到混合溶液。精密移取上述混合溶液各2 ml置超滤离心管中离心30 min，转速为4 000 r·min-1，取续滤液1 ml置10 ml量瓶中，加体积分数20%甲醇稀释定容，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表2。表2 方法回收率实验结果
2.9.2.3 包封率的测定
取hup asln适量，置超滤离心管中离心30 min，转速为4 000 r·min-1，取续滤液1 ml置10 ml量瓶中，加体积分数20%甲醇稀释定容，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，按“2.2”项下色谱条件进样，计算其中游离药物的量(wf);同时移取精密hup asln 1 ml,同“2.8”项下测定hup asln中总药物的含量，计算总药物的量(wo)，并计算包封率[包封率=(wo-wf)/wo×100%]。测得3批样品的包封率为58.42%、56.36%、58.11%，平均值为57.63%。
3 讨论
3.1 测定sln包封率的方法有多种，如葡聚糖凝胶柱法、鱼精蛋白沉淀法、冷冻超速离心法、微型柱法、透析法及超滤法等，其原理都是采用一定的方法使包封的药物和游离药物分离，测定包封或游离药物的浓度，计算包封率[7，8]。由于本实验所制备的sln粒径较小(30～100 nm)，冷冻超速离心(20 000×g)2 h仍未见分层，故该法不适合于hup asln包封率的测定。本文也曾尝试葡聚糖凝胶柱法分离hup asln中的游离药物，试验中采用蒸馏水作为洗脱剂时，游离药物的回收率仅为70%左右，可能是hup a易吸附在葡聚糖凝胶表面，蒸馏水对hup a溶解能力较小，难以洗脱下来;改用对hup a溶解能力较大的甲醇水溶液洗脱时，虽然hup a的回收率接近95%，但葡聚糖凝胶的结构发生破坏，洗脱过程中葡聚糖凝胶逐渐塌陷。
3.2 本实验包封率测定结果表明超滤法测得的包封率较透析法高，原因可能是透析法的测定过程所用的时间较长，在透析过程中被包封药物可能有部分泄漏。超滤法是在离心力的作用下，利用筛分原理对大分子和小分子物质进行分离：溶剂与部分相对分子质量小的溶质穿过超滤膜的孔道到达膜的另一侧，而相对分子质量大的溶质或纳米粒被截留，由于操作时间短，而且样品不必进行稀释，不存在被包封药物泄漏的问题。另外，从回收率试验结果可以看出，透析法仍然存在游离药物回收率低的问题，其准确度较低。超滤法操作简单、快速、重现性好，适用于石杉碱甲固体脂质纳米粒的包封率测定。
【 参考 文献 】
[1] 章海燕,唐希灿.石杉碱甲：具有 治疗 神经退行性疾病的前景药物[j].上海医药,2003,24(3): 112-120.
[2] 任晓辉,王伟.胆碱酯酶抑制药石杉碱甲的药理作用及临床应用研究进展[j].
