作者：张玲莉，何文，冯敏，张小杰
【摘要】 目的 以维生素a棕榈酸酯(vap)为主药，制备n三甲基壳聚糖(tmc)包衣的阳离子脂质体，对其角膜滞留性及刺激性进行研究。方法 采用薄膜分散法制备tmc60(季胺化程度为60%)包衣的vap脂质体(vapl)，即tmcvapl;采用悬挂泡技术和束缚泡技术进行离体眼球表面接触角及解吸附动力学研究;draize评分法结合组织学检查，评价其对兔角膜的刺激性。结果 vapl粒径分布均匀，tmc60包衣后荷正电性;与未包衣的vapl相比，tmcvapl在角膜表面接触角明显降低，解吸时间明显延长;对兔角膜无刺激性。结论 tmcvapl具有阳离子脂质体的优势，可延长角膜滞留时间，并具有良好的生物相容性，值得进一步研究。
【关键词】 维生素a棕榈酸酯;阳离子脂质体;角膜滞留性;眼刺激性
abstract:objective to prepare vitamin a palmitate(vap)loaded cationic liposomes with ntrimethyl chitosan (tmc)coating,and investigate their corneal retention and irritation behavior. methods vitamin a palmitate(vap)loaded liposomes (vapl) were prepared by the film dispersion method followed with tmc60coating (quaternization degree of 60%) to obtain tmc60coated vapl. the contact angle and corneal retention behavior were evaluated by sessile bubble technique and captive bubble technique. ocular irritation test was carried out based on the draize method and histological examination. result vapl was uniformly distributed with positive surface charge after tmc60coating and it exhibited smaller contact angle and longer corneal retention time with little corneal irritation after tmc60coating.conclusion tmc60coated vapl has advantages of cationic liposomes in extending the corneal retention time with promising biocompatibility,which deserves further study.
key words:vitamin a palmitate; cationic liposome; corneal retention; ocular irritation
维生素a对于维持正常的视功能具有重要作用， 治疗 干眼病时，在角膜表面滞留时间越长，治疗效果越好。WWW.11665.cOm维生素a不稳定，其原料以棕榈酸酯的形式存在(维生素a棕榈酸酯，vitamin a palmitate,vap)。研究表明，粒径为0.02～5 μm之间的脂质体滴入眼部无异物感，且易与生物膜融合，促进药物对生物膜的穿透性，同时角膜表面带有一定的负电荷，荷正电的阳离子微粒能够改善药物在角膜前的铺展，并明显提高药物的角膜滞留时间[1,2]。n三甲基壳聚糖(ntrimethyl chitosan,tmc)是壳聚糖的部分季铵化产物，在较宽的ph值范围内均有较好的溶解性，其荷正电性随着季铵化程度的增高而增大[3]，是一种应用广泛的阳离子高分子材料。
本研究制备季胺化程度为60%的tmc(tmc60)，以其为包衣材料制备vapl脂质体(vap liposomes,vapl)，tmcvapl，对该tmcvapl进行角膜接触角、滞留特性及兔眼刺激性考察，拟为研发vap新型眼用制剂奠定基础。
1 实验材料
1.1 仪器
emulsiflexc5高压均质机(加拿大avestin 公司);re52c旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);shz22恒温水浴振荡器(江苏太仓医疗器械厂);读数显微镜(重庆光学仪器厂)。
1.2 试药
vap(湖北省潜江制药股份有限公司，批号:050728);vap对照品(湖北省药品检验所提供，批号:60712，质量分数98.5%);维生素e(上海源聚生物科技有限公司，批号:080826);卵磷脂(国药集团化学试剂有限公司，批号:20050602);胆固醇(国药集团化学试剂有限公司，批号:f20050815);tritonx100(日本株式会社);磷酸盐缓冲液(pbs，ph6.5，参照2005年版 中国 药典配制);tmc60(实验室自制，季胺化程度64.3%，批号：081231);诺沛凝胶(规格:10 mg/g，批号: 413281，novaprtis pharma schweiz ag);谷胱甘肽碳酸氢钠林格溶液(gbr)： 参考 文献 [4]方法配制;其他试剂均为国产分析纯。
1.3 动物
家兔，体质量2～3 kg，雌雄各半，购自武汉生物制品研究所，合格证号：scxk(鄂)20080003。
2 实验方法
2.1 tmcvapl的制备
经正交试验筛选出vapl最优处方为：药脂比为1∶30，卵磷脂∶胆固醇∶维生素e的质量比为3∶1∶0.05。将处方量的vap、卵磷脂、胆固醇和维生素e置于500 ml的茄形瓶中，加入三氯甲烷40 ml，振荡溶解。于旋转蒸发仪上35 ℃减压除去溶剂，在瓶壁上形成均匀的类脂薄膜，取磷酸盐缓冲液15 ml(ph6.5)，倒入茄形瓶，轻摇，洗脱类脂膜，再置旋转蒸发仪上旋转水化，使薄膜全部洗下，即得到vapl初悬液。
称取适量tmc60溶于蒸馏水，制得质量浓度为0.35%的tmc60溶液，将vapl以1 ml/min的速度滴加到一定体积的tmc溶液中(tmc∶vapl=体积比4∶1[5])，以300 r/min速度边滴加边磁力搅拌，待脂质体滴加完后，再继续搅拌约10 min，即得初乳。将初乳经高压均质机在1.4×106 kpa压力下经50 nm膜挤压乳匀15次，得到tmcvapl纳米脂质体。
2.2 离体眼球表面接触角测定和滞留时间研究
2.2.1 兔眼球摘取 利用耳缘静脉注射空气针处死方法处死家兔，空气用量5～10 ml，开睑后分离球结膜，剪断眼肌后剪断视神经，眼球即被提出眼眶，取出眼球后迅速拉开上下睑及球结膜用湿热纱布填入眶内加压止血。小心除去腺体和结缔组织后，将离体眼球放入gbr溶液中保存。
2.2.2 接触角及滞留时间的测定[6] 以gbr及诺沛凝胶为对照，采用悬挂泡技术( sessile bubble technique)研究vapl及tmc60vapl与角膜的接触角：将新摘取的兔眼球固定于观测室顶盖的支架内,将其浸入(34±1) ℃待测溶液中,30 min后转移至50 ml预先用氧气饱和的ringer溶液[(34±1) ℃]中，立即用微孔不锈钢管鼓一个空气泡使之悬挂于角膜表面,用读数显微镜测定其宽度(w)和高度(h)，角膜表面的接触角用下式 计算 ：θ=cos-1(2h/w-1)，θ<90°。
采用束缚泡技术( captive bubble technique),以接触角的连续变化为指征，考察vapl及tmc60vapl从角膜表面解吸附的动力学过程。相关操作同悬挂泡法,但由微孔不锈钢管鼓出的空气泡应被束缚在钢管和角膜之间,保持气泡不动。每5分钟用读数显微镜观测1次,直至其宽度和高度不再发生变化(滞留时间为4只离体兔眼观测结果的平均值)。
2.3 生物相容性评定
2.3.1 眼刺激性试验 取健康白色家兔4只，给药前检查家兔的角膜、虹膜及结膜情况，以无病变或炎症者入选试验。将vapl、tmc60vapl各50 μl滴入每只家兔的右眼或左眼结膜囊内，被动闭合10 s，每日2次，连续7 d。停药后1、2、4、6、24、48、72 h记录眼部情况。依据体内眼刺激试验draize评分标准，将角膜、虹膜和结膜的刺激性分数累加作为眼部刺激分值[7]。眼刺激性评价标准：无刺激性0～3.9 分，轻度刺激性4～8.9 分，中度刺激性9～12.9 分，强度刺激性13～16 分。
2.3.2 组织学检查 家兔麻醉，心脏依次灌注生理盐水、4%多聚甲醛。耳缘静脉注射空气针处死方法处死家兔，按照“2.2.1”项方法摘取眼球，将受试角膜固定、切片、染色，用光学显微镜进行组织学检查，观察角膜结构和组织有无异常。
3 实验结果
3.1 tmc包衣vapl的体外性质考察
vapl和tmc60vapl的粒径均在纳米级以内，tmc60包衣后，zeta电位由负转正，见表1。透射电镜显示，tmc60vapl脂质体呈球形，粒度分布均匀，包衣后粒径稍有增大，见图1。表1 vapl、tmc60vapl的粒径、zeta电位测定结果
3.2 离体眼球表面接触角测定和滞留时间研究
接触角是用来评价制剂在角膜上铺展难易程度和滞留时间的常用指标。接触角小表明制剂在角膜上能够更加快速均匀地铺展，制剂的接触角在滞留时间过程的变化能够反映其在角膜表面的解吸附动力学变化[8]。
gbr溶液与兔眼角膜的接触角为( 41.72±1.40)°。vapl、tmc60vapl与角膜的接触角大小以及在角膜表面的解吸附动力学变化见图2。结果显示：tmc60vapl与角膜的接触角为(26.08±1.05)°，比gbr溶液减小了15.64°，未包衣的vapl、诺沛凝胶则分别减小了4.64°、9.87°，说明tmc60vapl能显著减小与角膜的接触角(p<0.05)，具有较好的角膜铺展性;tmc60vapl体外角膜滞留时间可达25 min以上，vapl、诺沛凝胶分别在15和20 min后解吸完全，说明tmc60包衣后，vapl在角膜表面滞留时间得到显著延长(p<0.05)。以上结果表明，tmc60vapl能够减小角膜接触角，具有良好的角膜铺展效果及滞留性。
3.3 眼刺激性试验结果
健康家兔连续给药7 d，于1、2、4、6、24、48、72 h至7 d观察，每只家兔的眼角膜、虹膜、结膜均无异常发现。vapl、tmc60vapl眼刺激反应评分分别为0 分和0.85 分，眼刺激程度为无刺激性。组织学检查结果表明，受试角膜结构完好，上皮组织未见异常，见图3。
4 讨论
由于tmc的正电性随着其季胺化程度的增加而增大，故我们选用季胺化程度为60%的tmc为包衣材料，以保证vapl的表面荷正电性。zeta电位测定结果表明，tmc60包衣后，vapl电荷由负转正，说明包衣成功，得到阳离子脂质体。
眼部滞留性实验结果表明，与gbr溶液及vapl相比，tmc60vapl能够显著降低与角膜的接触角，铺展效果良好;解吸时间明显延长，说明tmcvapl具有更长的角膜滞留时间。这可能是由于tmc60的正电荷和角膜的负电荷间形成静电结合的结果。
tmcvapl对家兔角膜、虹膜无明显的刺激性。结膜有轻微反应，但在停药后72 h症状基本消失。各观察时间的家兔眼刺激反应综合平均分值均在0～1分范围内，根据眼刺激评价标准，表明制备的tmcvapl对家兔眼睛无刺激性。组织学检查表明该体系有良好的生理相容性，说明该体系具有临床应用意义。
【 参考 文献 】
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