作者：徐欢 董斌 林月霞，田素娟 杜欣娥
【摘要】 目的 利用柠檬酸三钠作为还原剂，制备颗粒均一、分布均匀的纳米胶体金。方法 通过考察反应时间、搅拌速度以及初始沸腾时间3个因素来确定最佳的制备条件，以紫外吸收峰、粒径及透射电镜扫描结果进行综合评价。结果 胶体金溶液的最佳制备条件为：在200 r/min的搅拌速度加热至沸腾，沸腾后立即加入还原剂，反应12 min后停止搅拌;所制得的胶体金的粒径为20 nm左右。 结论 采用优化条件所制得的胶体金颗粒均一、分布均匀。
【关键词】 胶体金;纳米粒;制备方法;优化条件
abstract:objective to prepare the homogeneous particles and uniformly distributed colloidal gold nanoparticles with sodium citrate as reducing agent.methods the optimum preparation conditions were screened by changing the reaction time,stirring speed and initial boiling time,and uv spectrophotometer,particle size distribution apparatus,as well as transmission electron microscopy (tem) were comprehensively evaluated.results colloidal gold of about 20 nm particle size were prepared in conditions of being heated to boiling and added the reducing agent immediately at the stirring speed of 200 r/min of 12 min.conclusion homogeneous particles and uniformly distributed colloidal gold nanoparticles can be obtained in the optimum conditions.
key words:colloidal gold; nanoparticle; preparative method; optimum conditions
胶体金免疫层析法是20世纪90年代在美国兴起的一种基于免疫胶体金技术的快速诊断技术，是在 现代 单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上 发展 起来的新型检测技术。Www.11665.Com胶体金溶液是指分散相粒子直径在1～150 nm之间的金溶胶，属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫红色。1971年faulk和taylor将胶体金引入免疫化学中[1]，开始作为一种免疫标记技术使用，胶体金在免疫化学中的这种应用，又被称为免疫金，近年来胶体金标记已经发展为一项重要的免疫标记技术[2～3]。
胶体金的制备方法一般采用还原法，常见的有硼氢化钠还原法(2 nm)、白磷还原法(5 nm)、抗坏血酸还原法(8～12 nm)、柠檬酸鞣酸还原法(3～15 nm)、柠檬酸三钠还原法[4] (10～150 nm)，其中柠檬酸三钠法是最经典的方法，其基本原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的柠檬酸三钠使金离子还原变成金原子，其工艺简单，成本低廉，但在实际应用过程中很容易出现颗粒聚集、重复性差等问题，影响胶体金在免疫分析中的应用[5]。据 文献 报道，保持柠檬酸三钠和氯金酸的摩尔比恒定可初步控制胶体金的粒径范围[6]，但是颗粒的均匀度和分散度却与加热条件及加热时间有密切关系。
本文采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，对影响氯金酸和柠檬酸三钠水溶液反应的几种因素进行优化，选择出最佳的反应时间、沸腾时间以及搅拌速度，并通过紫外吸收峰、透射电镜结果及粒径对所制备的胶体金溶液进行综合评价，为制备胶体金免疫层析检测试纸奠定基础。
1 试剂与仪器
1.1 试剂
氯金酸(sigma公司原装进口)、柠檬酸三钠(国药集团化学试剂有限公司)等均为分析纯，使用前未经进一步纯化。实验用水均为经超纯水装置净化的二次去离子水，电阻率>18 mω·cm。
1.2 仪器
jj2000b分析天平[佛兰德(北京) 电子 有限公司]，sxjq1型数显直流无级调速搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)，tc15型恒温加热套(海宁市华星仪器厂)，spectronic 1.70紫外可见光分光光度仪(厦门联信诚有限公司)，jem1400透射电镜[日本电子株式会社(jeol)]，nano series nanozs90型粒度测定仪(英国马尔文仪器有限公司)。
2 胶体金溶液的制备
2.1 器皿的硅化
将所用器皿用酸液浸泡72 h，取出，大量自来水冲洗，蒸馏水浸泡24 h,干燥，用含5%的二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液进行硅化，硅化完成后用双蒸水冲洗多次，烘干。
2.2 柠檬酸三钠还原法制备胶体金
取质量浓度0.01%氯金酸水溶液100 ml加热至沸，搅拌下加入预热的质量浓度1%柠檬酸三钠水溶液4 ml，金黄色的氯金酸水溶液在2 min内变为灰色，然后由灰色变为酒红色，继续搅拌煮沸，直至溶液呈透亮的红色，冷却后用双蒸水定容至100 ml，4 ℃冰箱中避光保存。
2.3 制备胶体金条件的优化
分别在200、250、300 r/min的搅拌速度下，氯金酸水溶液煮沸0、2 min，加入柠檬酸三钠水溶液，煮沸反应10、12 min，制得胶体金溶液，然后进行质量鉴定。
2.4 胶体金的质量鉴定
2.4.1 肉眼观察
观察其颜色、均匀度和透明度。
2.4.2 可见光扫描鉴定
将冷却后的胶体金溶液在400～600 nm进行扫描，确定最大吸收峰波长，观察最大吸收峰的峰形和峰宽。
2.4.3 粒径分布情况
对胶体金颗粒从数量粒度分布、体积粒度分布、强度粒度分布等因素对胶体金的粒径分布情况进行测定分析。
2.4.4 透射电镜观察
透射电镜下观察胶体金颗粒的大小、均匀度、有无椭圆形及多角形、有无颗粒的聚集情况。
3 结果
3.1 制备条件的选取
氯金酸反应液在加热过程中的颜色变化时间随溶液起始沸腾时间和搅拌转速的不同而不同，随着加热时间的延长，溶液颜色变化过程为浅黄色→灰色→浅蓝色→紫红色→橘红色。本实验利用螺旋搅拌器转速的可控性以及加热套温度的可调性，通过改变反应过程中的搅拌速度和氯金酸溶液的初始沸腾时间以及加入还原剂后的反应时间，选取9种不同方案的制备条件，见表1。表1 制备胶体金的反应条件
3.2 胶体金质量评价
3.2.1 紫外扫描鉴定
胶体金溶液在可见光400～600 nm的扫描图谱见图1。从图1可见：胶体金的最大吸收峰在520～530 nm范围内，主峰宽度较小，说明胶体金溶液的粒径分布较均匀;9个实验样品中，7、8、9号的可见光吸收光谱的最大吸收峰明显向长波方向红移，其他6个样品的分散状态良好;初步推断搅拌速度的大小对胶体金溶液的分散状态有明显的决定作用。
1-9.不同条件制备的9个实验样品
图1 胶体金的可见光(400～600 nm)吸收光谱
figure 1 visible spectrum(400～600 nm)of colloidal gold
3.2.2 透射电镜扫描结果
胶体金电镜观察结果如图2所示。从图可见：样品1形状规则，粒径均匀，平均粒径为22 nm;样品2虽然形状规则，但有一定程度的聚集现象;而样品4与前两种样品的形状规则度与聚集情况相比，均有一定的差异。电镜结果与可见光吸收光谱的结果一致，说明搅拌速度越大，样品越容易发生聚集。
3.2.3 粒径测定结果
由可见光扫描结果与电镜扫描结果中选出峰形较优、颗粒较规则的胶体金的制备条件，见表2。表2 胶体金的优化制备条件
将以上样品利用粒径测定仪从数量粒度分布、体积粒度分布、强度粒度分布进行分析，以对分布性最灵敏的强度粒度分布为指标(见图3-5)，选出胶体金颗粒均一性(单分散系)最好的制备条件。
figure 5 the size distribution by intensity of sample 4 从图3-5可见，样品1与其他两种条件下制备的胶体金溶液进行对比，具有良好的均一性，其平均粒径为22.7 nm，多分散指数(pdi)为0.201(pdi表示体系中粒径的分散程度，数值越小表示体系中的颗粒粒度分布越集中),表明还原剂的加入时间对溶液的分布情况也有一定的影响。
综上分析，经过可见光吸收光谱和透射电镜以及粒径分布扫描的判断，选择本实验胶体金制备的最佳条件为：0.01%氯金酸水溶液100 ml在200 r/min的搅拌速度加热至沸，沸腾后立即加入还原剂，反应12 min后停止搅拌，室温冷却，并定容至100 ml。
3 讨论
胶体金的质量受还原剂的用量、反应时间、搅拌速度等因素的影响[7]。本实验研究证明搅拌速度是影响胶体金制备的主要因素，其次是沸腾时间和加入柠檬酸三钠后的反应时间。还原剂柠檬酸三钠要一次迅速加入，不要多次加入。搅拌不均匀、搅拌速度太慢等，易造成颗粒大小不等[8]。胶体金应放在4 ℃保存，避免低温冻存，因为冻存可导致胶体金凝聚，破坏胶体状态，胶体金可在4 ℃保存6个月左右[9]。由于胶体金的不稳定性和聚沉的可能性，胶体金溶液宜尽快进行标记。
本实验利用调速搅拌器和加热套作为搅拌和加热装置，大大改善了磁力搅拌器在搅拌过程中出现的漩涡现象以及局部受热不均匀的情况，从而在搅拌速度合理的前提下，在反应起始快速搅拌混匀反应物，随后慢速搅拌，这样能很好地改善形成湍流的情况，从而制备出的颗粒均匀胶体金颗粒。
本实验通过控制还原剂的量分别制备了15 nm和22 nm两种粒径的胶体金颗粒，所加入柠檬酸三钠的量分别为4 ml和2 ml，但制备结果显示粒径为15 nm的胶体金平均粒径在18～20 nm，粒径为22 nm的平均粒径为24～26 nm左右，显示胶体金的粒径虽与还原剂的加入量有关，但是人为操作的误差对粒径大小也有一定的改变，制备过程中不能完全按照还原剂比例的多少来确定粒径，否则对标记会有很大影响。
本实验在衡量胶体金质量的过程中增加了粒度分布情况这一指标，从而在电镜鉴定颗粒形状的基础上，能更好地对胶体金溶液的分布情况进行评价，制备出质量更优良的胶体金溶液，为胶体金免疫层析检测提供了切实有效的标记材料。
【 参考 文献 】
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