作者：文海涛，赵红英，林励，邱贤秀
【摘要】 目的 通过克隆技术获得参与檀香挥发油形成的萜烯合成酶基因。方法 利用ctablicl法提取檀香已结香心材总rna，采用rtpcr技术克隆萜烯合成酶基因。结果 克隆获得了一个檀香萜烯合成酶基因，该基因编码区全长1 731 bp，编码576个氨基酸残基。结论 ctablicl法能提取较高质量的檀香心材总rna，克隆获得的萜烯合成酶具有编码区。
【关键词】 檀香;萜烯合成酶;基因克隆;序列分析
abstract:objective to clone the terpene synthase gene from santalum album l. which participates in the synthesis of essential oil. methods ctablicl treatment was used to extract total rna from the heartwood of santalum album l.and rtpcr was employed to clone the terpene synthase gene at the same time.results one terpene synthase gene consisted of 1 731 bp nucleic acid was cloned from santalum album l.,which encodes 576 amino acid residues. conclusion ctablicl treatment could extract high quality rna from the heartwood of santalum album l.,and the cloned terpene synthase gene had the open reading frame.
key words:santalum album l.; terpene synthase; gene cloning; sequence analysis
名贵中药檀香为檀香科植物檀香(santalum album l.)的树干心材，为行气温中、开胃止痛之常用中药[1]。www.11665.CoM檀香原产于印度、印度尼西亚等地，1962年华南植物园从印尼引种檀香并在广东地区试种成功[2]。檀香在 自然 生长情况下需10年左右才能初步形成具有芳香气味的心材(俗称结香)，30年以上才能供药用，檀香心材挥发油是其主要活性成分，已有研究表明檀香挥发油主要成分为萜烯类化合物，其中檀香醇等倍半萜烯类占挥发油总量的60%～80%[3]。
目前国内外对檀香研究的报道主要集中于檀香栽培技术和檀香挥发油组分分析上[4]，而对檀香心材挥发油积累机理却鲜见报道。鉴于此，本研究拟对参与檀香萜烯类化合物生物合成过程中的关键酶——萜烯合成酶基因进行克隆和分析。萜类物质的前体异戊烯基焦磷酸在萜烯合成酶的作用下形成不同的萜类骨架，经过不同修饰酶的作用后形成不同的萜类化合物，该酶基因的克隆将为阐明檀香挥发油积累的机理提供理论支持，同时也为利用基因工程手段培育檀香良种、缩短檀香生长年限以及提高檀香挥发油含量等方面研究奠定坚实的基础。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
1.1.1 材料 供试材料为广东湛江南药试验场的已结香檀香(santalum album l.)心材，檀香树由广东省中药研究所邱金裕研究员鉴定为檀香科植物檀香santalum album l.。采用钻孔取样的方式收集已结香部分心材，装入试管后迅速放入液氮罐速冻，取回后保存于-80 ℃冰箱。
1.1.2 试剂
rna提取试剂包括溶液ⅰ与溶液ⅱ，溶液ⅰ: 2%ctab,2%pvpk30,2 mol·l-1nacl，100 mmol·l-1trishcl (ph8.0)，25 mmol·l-1 edta(ph8.0)，0.5 g·l-1亚精胺。溶液ⅱ: 0.5%sds，1 mol·l-1 nacl，10 mmol·l-1trishcl(ph8.0)，1 mmol·l-1edta(ph8.0)，2种试剂均用depc水配制。反转录试剂盒：采用takara公司的primescript tm 1st strand cdna synthesis kit。克隆试剂盒：采用北京天根生化科技有限公司的pgmt试剂盒。taq dna聚合酶、dntp、dna marker、t4 dna ligase、限制性内切酶等均为takara产品;引物合成和测序由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。其他试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 檀香心材rna提取
参照chang等[5]方法进行提取并稍加改良。改良之处为用三氯甲烷/异戊醇(24∶1)抽提两次、用10 mol·l-1 licl沉淀过夜，其他不变。
1.2.2 反转录
采用takara公司primescript tm 1st strand cdna synthesis kit反转录rna成cdna。步骤为：(1)在离心管中依次加入总rna 4 μl，oligo(dt) 1 μl，dntp(10 mmol·l-1) 1 μl，加rnase free water至总体积10 μl;(2) 65 ℃保持5 min，迅速取出冰上放置3 min;(3)按顺序分别加入5×buffer 4 μl，rnase inhibitor 0.5 μl，rnase free water 4.5 μl，prime script rtase 1 μl，42 ℃保温1 h，70 ℃灭活15 min。于-20℃保存备用。
1.2.3 pcr扩增
根据已登录ncbi的同源序列设计引物：f：5′tat gga tgc ctt tgc cac ttc tcc gac ctc3′;r：5′ttc aat cct cct cgt tca gtg gaa tag ggt3′。pcr扩增体系：包括premix la taq 25 μl，引物f和r各2 μl(10 μmol·l-1)，模板cdna 2 μl，补充ddh2o 至总体积50 μl。
pcr扩增条件：94 ℃，4 min;94 ℃，50 s，59 ℃，50 s，72 ℃，2 min;34循环;72 ℃，10 min。
1.2.4 基因克隆与序列分析
扩增产物电泳检测后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带，回收产物定量后与克隆载体pgmt连接，转化大肠肝菌dh5α，蓝白斑筛选后挑取白色单克隆进行扩大培养，选取经酶切和pcr鉴定含有目的片段的克隆送英潍捷基公司测序，测序结果通过ncbi中blastn和dnastar以及dnassist软件进行序列拼接和比对分析。
2 结果与分析
2.1 檀香心材总rna提取
采用ctab提取、licl沉淀法提取的檀香心材总rna，经1.0%甲醛变性凝胶电泳后，结果如图1所示。从图1可以看出，提取的檀香心材总rna其28s和18s条带较清晰，稍有降解。用核酸蛋白仪测定rna的质量，结果其a260/a280值均在1.6～2.0之间，a260/a230的值在2.0～2.3之间，说明此方法提取的rna质量较好，可以用于后续实验。
2.2 檀香萜烯合成酶基因克隆
取上述rna中的3号样品进行rtpcr，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。在约1.8 kb大小的位置有一条带，与预期片段大小一致。凝胶回收该目的片段，连接pgmt载体，转化大肠杆菌dh5α，并进行蓝白斑筛选。
figure 2 rtpcr of terpene synthase gene蓝白斑筛选后，随机挑取几个白斑摇菌，抽提质粒，质粒经rnase a消化后分别用ecorⅰ进行酶切和pcr扩增鉴定，结果如图3所示。从图3可知，每个单菌落经酶切后都得到大小约1.8 kb的条带，pcr扩增同样能扩增出片段，初步确定挑取的单菌落为阳性克隆子，含有目的片段。
2.3 檀香萜烯合成酶基因序列分析
将经初步鉴定的阳性克隆送英潍捷基公司测序，通过序列拼接后得到全长为1 812 bp的序列，含有1 731 bp编码区，编码576个氨基酸残基，重命名为tps1。利用ncbi中的blastn进行序列比对，发现该序列与已在genbank登录的一个同样来自于檀香(白檀)的单萜合成酶基因序列(eu798692)同源性为99%，在全部1 731个碱基中只有6个存在差异。两个序列编码的氨基酸序列比对后发现，其同源性同样为99%，氨基酸残基在4个位点上存在不同，分别是53位s/t、529位h/y、439位t/i和515位d/g，此外两个氨基酸序列都具有植物萜烯合成酶家族的保守区域。因此初步推断本研究获得的基因为檀香萜烯合成酶基因。
3 讨论
檀香药用部位主要为结香的心材，檀香心材的形成过程也就是檀香挥发油积累的过程，因此参与檀香挥发油形成的萜烯合成酶基因只在结香的心材中特异地表达，另外由于植物木质部细胞本身的原因，所以给本研究rna的提取造成了一定困难。本研究在尝试不同方法提取檀香心材总rna的时候效果都不理想，造成rna提取困难的原因可能是檀香心材本身次生代谢产物多，核酸难以溶出或与其他产物结合被除掉。此外，心材部分不是分生组织活跃的区域，活细胞少可能是造成提取后产量不高的原因。经过多次试验，本研究最后选用chang等[5]的方法，并在此基础上稍加改良，采用两次抽提去除杂质,加长沉淀时间至过夜的方法获得了较高质量的rna，可以用于后续rtpcr进行基因克隆。分析其原因可能是重复抽提去除了更多的影响rna的蛋白质和多糖等杂质，另外在沉淀初期随着时间的延长rna的量会增加，但并不是时间越长越好。
本研究获得了一个檀香合成酶基因，进一步的功能验证正在进行。这为阐明檀香中萜烯化合物生物合成奠定了基础，将为最终利用基因工程手段培育檀香良种和提高檀香品质提供 科学 依据。
【 参考 文献 】
[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典：一部[m]. 北京：
